Molecular cloning and production of recombinant hODF extracellular domain

Abstract

İnsan osteoklast değişim faktörü (hODF), osteoblastlar tarafından üretilen membrane proteinidir. Proteolitik olarak kesilmesiyle 143-317 amino asitlerden oluşan kesik-ekstraselüler domainini açığa çıkarır. hODF ekstraselüler domaini osteoclast membranındaki reseptörü olan RANK'e bağlanır ve aktive eder. Aktive edilmiş RANK, NF-KB'nin aktivasyonuna ve hücre çekirdeğine lokalize olmasına sebep olan hücre içi sinyal yolağını tetikler ve osteoklastogenik genlerin transkripsiyonuna sebep olur. Bu nihayetinde osteoklastların farklılaşmasını ve aktivasyonu ile sonuçlanır ki bu da kemikleri yeniden biçimleme yanıtıdır. Osteoklast oluşumunu in vivo ve in vitro olarak çalışabilmek için yeteri miktarda hODF proteinine ihtiyaç duyulur ki ilerki basamaklarda RAW264.7 osteoklast oluşum deneyinde ve in vitro bağlanma testlerinde kullanılabilsin. Bu yüzden biz rekombinant hODF ekstraselüler domainini ekspresyonuna ve saflaştırılmasına karar verdik. Rekombinant hODF, insan hücresinden elde edilen genomic DNAdan oluşturuldu ve moleküler klonlama yöntemleriyle birkaç ekspresyon vektörlerine klonlandı. Farklı saflaştırma statejilerinin denenmesi ve optimize edilmesinden sonra, GST tag edilmiş hODF bakterilerin içinde ekspres edilip glutatyon-agaroz boncuklarıyle saflaştırıldı. hODF, HRV3C proteazı ile boncuklardan ayırıldı ve sonuçlar SDS-PAGE ile analiz edildi. Geliştirdiğimiz protokol ile yaklaşık milligram miktarlarında ve %70 saflıktan daha fazla düzeyde hODF üretildi.

Human osteoclast differentiation factor (hODF) is a membrane protein expressed by osteoblasts. Its proteolytic cleavage releases a truncated ecto-domain composed of its extracellular domain between amino acids 143-317. hODF extracellular domain, binds to and activates its receptor RANK on osteoclast membrane. Activated RANK triggers an intracellular signaling pathway which leads to activation and nuclear localization of NF-KB and transcription of osteoclastogenic genes. This eventually results in differentiation and activation of osteoclasts, eliciting a bone remodeling response. To study osteoclastogenesis in vivo and in vitro requires a significant amount of hODF protein which can be used in downstream experiments such as RAW264.7 osteoclastogenesis assay and in vitro binding assays. Therefore, we decided to express and purify recombinant hODF extracellular domain. Recombinant hODF DNA was generated from human cellular genomic DNA and cloned into several expression vectors by PCR based molecular cloning methods. After trial and optimization of different purification strategies, GST tagged hODF was expressed in bacterial cells and purified by glutathione–agarose beads. hODF was released from the beads by proteolytic cleavage by HRV3C protease and results were analyzed by SDS-PAGE. The protocol we developed enabled us to produce sub-milligram quantities of hODF with higher than %70 purity.