Potential regulatory effects of fluidic shear stress through C-met signalling on biological behaviours of hepatocellular carcinoma cells

Abstract

Tümör metastazı kanser ile ilişkili ölümlerin en yaygın nedenidir. Bir tümörün metastaz yapabilmesi için primer tümörden ayrılarak dolaşıma geçmesi, dolaşımda sağ kalması, hedef organda yerleşerek çoğalması gerekmektedir. Solid tümörlerde kan akımı, doku ve lenf sıvılarına bağlı ortaya çıkan mekanik stres-sıvı teğetsel gerilme stresi (fluidic shear stress :FSS) tümör hücrelerinin proliferasyonunda, apoptoz, otafaji, invazyon ve metastaz gelişiminde önemlidir. Birçok klinikopatolojik çalışma, hepatoselüler karsinomada (HCC) intravasküler yayılımın kötü prognostik faktör olduğuna ve metastaz oluşumundaki önemine dikkati çekmektedir. Tümör hücreleri sinüzoidlere veya kan dolaşımına geçerek FSS ile karşılaştığında genelde anoikis veya mekanik travma nedeniyle ölmektedir. HCC'de intrahepatik metastazın yaygın olduğu, metastazın genelde invazyon bağımsız olarak gerçekleştiği, gerek intrahepatik gerekse ekstrahepatik metastaz için FSS'de sağkalımın kritik bir basamak olduğu bildirilmiştir. Ancak bu sürecin mekanizmaları ile açıklandığı yeterince çalışma bulunmamaktadırDaha önceki çalışmalarımız Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF) /c-Met yolağının HCC'de hücre sağkalımı, invazyon ve metastazı düzenlediğini göstermiştir. Bu çalışmada, HGF/c-Met yolağının, FSS varlığında HCC hücrelerinin sağkalımındaki rolünü araştırdık. Bu amaçla mikroakışkan bir sistem kullanarak c-Met ekspresyonu yüksek (SNU-449) ve düşük olan (HuH-7 ve HepG2) HCC hücre hatlarında, c-Met'in aktive ve inhibe edildiği koşullarda, FSS uyguladık. c-Met ekspresyon ve aktivasyonu qRT-PCR ve WB, sağkalım ve proliferasyonu tripan mavisi, (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) (MTT) ile zaman bağımlı olarak inceledik. Ayrıca FSS'nin koloni oluşumu ve epitelyal mezenşimal dönüşüme (EMT), motilite ve invazyonuna etkisini belirledik. Verilerimiz FSS koşullarının HCC hücrelerinde EMT fenotipini uyardığını; c-Met ekspresyon ve aktivasyon düzeyinin yüksek olduğu FSS varlığında sağkalımın, adhezyon ve proliferasyon kapasitesinin daha yüksek olduğunu; c-Met aktivasyonunun bu etkiyi artırdığını, buna karşın spesifik olarak c-Met yolağını inhibe eden küçük molekül inhibitör (SU11274) uygulamasının ise bu etkiyi tersine çevirdiği gösterilmiştir. Çalışmamız, HGF-Met sinyal yolağının insan HCC hücrelerinin FSS varlığında sağkalımında ve daha agresif karakter kazanmasında kritik bir role sahip olduğunu, c-Met'i bloklayan inhibitörlerinin, dolaşımdaki tümör hücrelerinin sağkalımının veya HCC de metastazın engellenmesinde kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Tumour metastasis is the most common reason of the cancer related death. Metastasis process requires cancer cells to detach primer tumour and intravasation to blood circulation and survive the shear stress in blood stream, homing and proliferation in the secondary organ. Fluidic shear stress (FSS) in blood circulation effects tumour cell's survival, apoptosis, invasion, metastasis and proliferation. Several clinic-pathological studies underline that in HCC intravascular invasion is poor prognosis factor and it is significantly important in metastasis. When tumour cells intravasate to sinusoidal capillaries, shear stress stimulate apoptosis. Frequency of intrahepatic metastasis is high in HCC and it occurs as invasion dependent manner indicating survival of tumour cells under FSS is crucial step for intrahepatic and extrahepatic metastasis. Nevertheless mechanisms behind process hasn't been illuminated adequately yet. Our previous studies showed that HGF/c-Met pathway plays crucial role in cell survival, invasion, metastasis during hepatocarcinogenesis. In this study we aimed to examine the role of HGF/c-Met pathway on survival and proliferation of HCC cells under FSS. In order to do this, we used peristaltic pump to apply FSS to HCC cells which have low (HuH-7 and HepG2) and high (SNU-449) c-Met levels. c-Met expression and activation levels were determined by RT-qPCR and Western blotting, cell survival and proliferation analysis by trypan blue and (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT) in HCC cells. The effect of FSS on colony formation, epithelial-mesenchymal transition (EMT) and invasion were determined by 3D microfluidic system. Our data showed that, FSS treatment increased the expression and activation of c-Met stimulating EMT phenotype, cell survival, proliferation and invasion in HCC cells and c-Met inhibitor (SU11274) reversed these effects suggesting HGF/c-Met pathway has critical role on the survival of HCC cells under FSS and induces aggressive phenotype and c-Met inhibitors could be used to inhibit survival of circulating tumour cells' metastasis in HCC.