Development of lysosomal acid lipase deficiency model in 3 dimensional hepatic organoids

Abstract

Son zamanlarda, organoidler sağlık ve hastalıkta insan biyolojisini incelemek için oldukça güçlü bir hücre kültürü yöntemi haline gigureelmiştir. Organoidler, ekstraselülar matriste büyütülen, organın yapısını ve fonksiyonlarını gösteren üç boyutlu yapılardır. Son zamanlarda karaciğere özgü organoidler için yayınlanmış protokoller hastalık patolojisinin anlaşılmasını ve hastaya özgü tedavilerin geliştirilmesini sağlamakta yeni bir dönemin açılmasını sağlamıştır. Bu çalışmada amacımız Lizozomal asit lipaz eksikliği (LALD) için bir model geliştirmektir.Lizozomal asit lipaz (LAL), çoğunlukla olarak karaciğerde bulunan ve kolesterol esterlerini serbest kolesterole parçalayan bir enzimdir. LAL enziminin yokluğunda, karaciğer hücrelerinde kolesterol esterleri birikmeye başlar ve çeşitli şiddetlerde lizozomal asit lipaz eksikliği patolojileri gözlenebilir. LALD spektrumunun en şiddetli formu, Wolman hastalığıdır ve maksimum % 1 LAL aktivitesi olan bu hastalar çoğunlukla hayatlarının ilk bir yılı içinde hayatlarını kaybetmektedir. Bununla birlikte, kolesterol ester depo hastalığı, % 3 ila% 5 enzim aktivitesine sahip daha hafif formları isimlendirmek için kullanılır. Bu hastalar, teşhis dahi konmadan erişkinliği boyunca yaşayabilen ve ancak yetişkin yaşlarda bazı semptomlar göstermektedir.Lizozomal asit lipaz eksikliği modelleri şu ana kadar hayvan modelleriyle sınırlıdır ve kişiselleştirilmiş bir yaklaşım geliştirilmek istendiğinde bu modeller oldukça yetersizdir. Yakın zamana kadar, LALD'yi modelleyen hücre hatları ya da modelleri bulunmamaktaydı, ancak yakın zamanda yapılan bir çalışmada hasta kaynaklı uPKH'lerden Wolman Hastalığı organoidleri oluşturulmuş ve böylece hastalık için moleküler mekanizma ve tedavi seçeneklerinin anlaşılmasının önü açılmıştır. Bu tez çalışmasında öncelikle, LIPA geni için indüklenebilir bir shRNA vektörünü kalıcı olarak eksprese eden uPKH klonları oluşturulmuş, daha sonra LALD için bir uPKH kaynaklı endodermal hepatik organoid (eHEPO) modeli ve 2 boyutlu (2B) hepatosit modeli yapılmıştr. LAL eksikliği olan 2B hepatositlerin, sağlıklı olanlara kıyasla LAL enzim aktivitesi seviyelerinde azalma gösterilmiştir. Ancak, eHEPO modelimizde, LIPA gen ekspresyonunda % 40'lık bir düşüşün ardından LAL enzim aktivitesinde düşüş gözlenmemiştir. Bu nedenle, hastalık fenotipini taklit etmek için gen ekspresyon seviyesinde daha dramatik bir düşüşün gerekli olduğu ve bunun sebebinin 3B organoid modelinde enzim aktivitesinin daha sıkı bir şekilde düzenlenmesinin neden olabileceği sonucuna varılmıştır. Bu durum, hastalık mekanizmasını anlamak için moleküler değişikliklerin ve enzim aktivitesini düzenleyen yolakların daha detaylı araştırılması gerektiğini göstermektedir.

In the last decade, organoids have become the most powerful cell culture tool to study human biology in health and disease. Organoids are three-dimensional structures grown in an extracellular matrix that resemble organ structure and show organ-specific functions. Recently established protocols for liver-specific organoids enables the understanding of disease pathology and improvement of patient-specific therapies. Our aim in this work is to utilize organoid technology to model Lysosomal acid lipase deficiency (LALD).Lysosomal acid lipase (LAL) is an enzyme, mainly found in the liver, that breaks down cholesterol esters into free cholesterol. In the absence of the LAL enzyme, cholesterol esters begin to accumulate in liver cells and a spectrum of symptoms can be observed. The mild form with 3%-5% enzyme activity is called cholesterol ester storage disease (CESD) and it can go undiagnosed for years but the severe form is Wolman's disease with less than 1% LAL enzyme activity. Unless treated, WD patients have a life span of maximum a year. LALD models are limited to animal models. These models are completely inadequate when a personalized approach is desired to be developed. Until recently, there were no cell lines that model LALD, however, a recent study has established Wolman Disease organoids from patient-derived iPSCs and thus, paved the way for the understanding of molecular mechanism and treatment options for the disease. In this thesis, first, we have established iPSC clones stably expressing an inducible shRNA vector for the LIPA gene, then we have created an iPSC derived 2D hepatocyte and 3D endodermal hepatic organoid (eHEPO) model for the LALD. LAL deficient 2D hepatocytes have shown to have decreased levels of LAL enzyme activity in comparison with healthy counterparts. On the contrary, our eHEPO model has not been successful to show LAL enzyme activity impairment after a 40% reduction in gene expression. Thus, we conclude that a more dramatic decrease in the gene expression level is needed to mimic the disease phenotype. This suggests that strict regulation of the enzyme activity is present in the 3D organoid model and further investigation of molecular changes and regulation pathways is needed to understand the disease mechanism.