Investigation of the effects of diethyl maleate on NLRP3 ınflammasome activation in microglial cells

Abstract

Mikroglial hücreler merkezi sinir sisteminin (MSS) dokularda yaşayan makrofajlarıdır (Dubbelaar, Kracht et al. 2018). Beyinde bir akut hasar oluştuğunda, mikroglia, hücresel kalıntıları, invaze eden mikrobiyel organizmaları ve MSS'ye zararı olan diğer bileşenleri fagosite ederler. Diğer bir yandan, sitokinleri salgılamakla sorumludurlar. Bunu merkezi sinir sisteminde immün yanıta destek olarak gerçekleştirirler (Dubbelaar, Kracht et al. 2018). İnflamazom aktivasyonu, IL-1β ve IL-18 sitokinlerinin salınımına, Kaspaz-1 aktivasyonuna ve olası piroptotik hücre ölümüne yol açan inflamatuar yanıtı başlatır (Yang, Wang et al. 2019). Bu sepeble, bu gibi durumlarda inflamazom aktivasyonunun önlenmesi gerekmektedir. Anti-inflamatuar özellik gösteren birtakım kimyasallar inflamazom aktivasyonunu engellemek adına uygun adaylar olabilmektedir. Dietil Maleat bir Nrf2 indükleyicisidir ve Nrf2 yolağına bağlı olarak, DEM'in, inflamatuar sitokinlerinin salınımını ve olası hücre ölümünü inhibe edeceği öngörülmektedir. DEM'in LPS+ATP ile indüklenmiş NLRP3 inflamazom aktivasyonu kaynaklı hücre ölümünü baskıladığı hipotez edilmektedir. Bu tezde, DEM'in N9 mikroglial hücre hattında NLRP3 inflamazom aktivasyonu üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, N9 hücre hattında NLRP3 inflamazom aktivasyonu LPS ve ATP ile indüklenmiştir. Hücreler, inflamazom aktivasyonu üzerindeki etkisini belirlemek adına DEM ile muamele edilmiştir. DEM'in uygulanan koşullar altında sitotoksisitesi LDH (Lactate Dehydrogenase) ve PI görüntüleme yöntemleriyle belirlenmiştir. Sonrasında, inflamazom markörleri mRNA düzeyinde PCR ile, protein düzeyinde ise Western Blotlama ve ELISA yöntemleriyle incelenmiştir. DEM ön muamelesinin NLRP3 inflamazom aktivasyonu kaynaklı inflamatuar sitokin salınımını ve hücre ölümünü baskıladığı belirlenmiştir.Anahtar kelimeler: Dietil Maleat, mikroglia, N9, inflamazom, NLRP3, piroptoz, LPS, ATP

Microglial cells are tissue-resident macrophages of the Central Nervous System (CNS) (Dubbelaar, Kracht et al. 2018). In case of an injury in the brain, microglia act through their phagocytic function and eliminate invading microbes and other substances that harm the CNS. Also, they are responsible for secretion of cytokines assisting the immune response within the CNS (Dubbelaar, Kracht et al. 2018). Inflammasome activation initiates inflammatory responses leading to secretion of IL-1β and IL-18 cytokines and activation of caspase-1, and may also lead to pyroptotic cell death (Yang, Wang et al. 2019). For this reason, inflammasome activation should be prevented under such conditions. Chemicals with anti-inflammatory effects are appropriate candidates to inhibit inflammasome activation. Diethyl Maleate (DEM) is a Nrf2 activator and correlatively, DEM has been estimated to inhibit secretion of inflammatory cytokines and possible cell death. It is hypothesized that DEM represses LPS+ATP induced NLRP3 inflammasome activation caused cell death of N9 cells. In this thesis, effects of DEM on NLRP3 inflammasome activation in N9 microglia was investigated. NLRP3 inflammasome activation via LPS+ATP was performed. N9 cells were treated via DEM in order to determine the effect on inflammasome activation. The cytotoxicity of DEM in regarding conditions was determined via LDH (Lactate Dehydrogenase) and PI visualization. Afterwards, inflammasome markers were examined at mRNA level via PCR, at protein level via Western Blotting and ELISA. It was determined that DEM pretreatment represses inflammatory cytokine secretion and cell death arising from NLRP3 inflammasome activation. Keywords: Diethyl Maleate, microglia, N9, inflammasome, NLRP3, pyroptosis, LPS, ATP