Sığır karaciğeri ve insan plasentası organik nitrat redüktazının saflaştırılması ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

6 - ÖZET Bu çalışmada, organik nitrat redüktaz (EC.1.8.6.1) sığır karaciğeri ve insan plasentasından saflaştırıldı ve enzimin bazı kinetik özellikleri incelendi. Enzim, amonyum sülfat ve etanol çökeleği oluşturularak, sonra kalsiyum fosfat jel üzerinde adsorpsiyon yapılarak saflaştırıldı. Organik nitrat redüktaz bu metod ile 72.3 defa sığır karaciğerinden ve 182.6 defa insan plasentasından saflaştırıldı. Daha sonra, sığır karaciğeri ve insan plasentası organik nitrat redüktaz için kinetik çalışmalar yapıldı. Saflaştırılan insan plasentası organik nitrat redüktazm izosorbiddinit- rat sübstratı için Km ve Vm değerleri sırayla 1.85 mM ve 0.387 /zmol/h/ml. bulundu; ve saflaştırılan sığır karaciğeri organik nitrat redüktazm aym sübstrat için Km ve Vm değerleri sırasıyla 1.30 mM ve 0.900 fraıol/h/ml. olarak bu lundu. Enzimin optimum pH değeri 7.4 ve optimum inkübasyon süresi 5 ve 10 dakika idi. Bu çalışmada; saflaştırılan insan plasentası ve sığır karaciğeri organik nitrat redüktaz üzerine bazı iki değerli katyonların (Fe+2, Cu+2, Zn+2, Mo+2) in vitro etkileri incelendiğinde, Zn+2 ve Fe+2 her iki tür enzimin unkompetitif inhibitörleri olmasına rağmen Cu+2'nin nonkompetitif inhibitor olduğu gözlendi. Mg+2 sığır karaciğeri organik nitrat redüktazı kompetitif inhibisyon olarak inhibe etti. Mo+2, sığır karaciğeri ve insan plasentası organik nitrat redüktazının aktivatörü olarak bulundu.

7 - SUMMARY In this study, organic nitrate reductase (EC.1.8.6.1) was purified from human placenta and cattle liver and some kinetic properties of the enzyme were studied. Enzyme was purified by forming the precipitate of ammonium sulfate and ethanol, then by adsorption on calcium phosphate gel. Organic nitrate reductase was purified 72.3 times from cattle liver and 182.6 times from human placenta with this method. Then, kinetic works were done for cattle liver and human placental organic nitrate reductase. The Km and Vm values of purified human placental organic nitrate reductase were found to be 1.85 mM and 0.387 /raiol/h/ml., respectively, by using isosorbidedinitrate as substrate; and the Km and Vm values of purified cattle liver organic nitrate reductase were found to be 1.30 mM and 0.900 jttnol/h/ml., respectively, by using the same substrate. Optimum pH value of the enzyme was 7.4 and optimum incubation time duration was 5 and 10 minutes. In this study; when in vitro effects of some divalent cations (Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mo2+) on the purified human placental and cattle liver organic nitrate reductase were investigated, it was observed that Zn2+ and Fe2+were uncompetitive inhibitors, whereas Cu2+ was a noncompetitive inhibitor of the enzyme obtained from the both species. Mg2+ inhibited cattle liver organic nitrate reductase by competitive inhibition. Mo2+ was found to be as an activator of both cattle liver and human placental organic nitrate reductase.