İnek sütü ksantin oksidazının saflaştırılması ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, inek sütünden, ksantin oksidoredüktaz (XOR)'ın serbest radikal üretimine yol açan Tip O formunda saflaştırılması ve saflaştırılan enzimin kinetik özelliklerinin incelenmesini takiben, SOD aktivitesi tayininde kullanılabilirliğinin araştırılması planlandı. Dithiothreitol (DTT) (T) içeren ve içermeyen (E) ortamlarda enzim saflaştırılması yapıldı. Ksantin oksidaz, DTT'siz ortamda 23.74 kez, DTTli ortamda 74 kez saflaştırıldı. İki farklı ortamda saflaştırılan enzimin SDS-PAGE ile molekül ağırlığı 80.000 D olarak belirlendi. Ksantin oksidaz (I ve II) için optimum sıcaklık 25°C, optimum pH 8,0 olarak bulundu. Ksantin oksidaz (I ve II)'nin ksantin substratına ait Km değerleri sırasıyla 0,034 mM, 0,047 mM olarak ve maksimum hız değerleri 800 uM/dk, 813 uM/dk olarak hesaplandı. N-nitrozomorfolin (NMOR)'in, DTTli ve DTTsiz ortamda saflaştınlan enzimi nonkompetitif oalrak inhibe ettiği gözlendi. Saflaştırmayı takiben ^O^C'de, 3 aylık sakalama süresi içinde, XO(I)'in aktivitesinin değişmediği, XO(ü)'m aktivitesinin ise % 29 oranında azaldığı görüldü. Sadece DTTli ortamda saflaştırılan enzimin, uygun bir düzeltme faktörü yardımıyla, SOD aktivitesi tayininde kullanılabileceği belirlendi. Sonuç olarak DTTsiz ortamda saflaştırılan fakat DTTli ortamda, -20°C'de sakalanılan inek sütü XO'in; SOD tayinininde, bir düzeltme faktörü yardımıyla, kullanılabileceği görüşüne varıldı.

Our objectives were to purify the Type O form of Xanthine oxidoreductase (XOR) which leads to free radical generation from bovine milk and to examine whether this purified enzyme could be used in the determination of SOD activity followed by the examination of kinetic properties of XOR. The purification of XOR was carried out under two different mediums, in the presence (I) or absence of dithiothreitol (DTT) (II). The rate of purification was found to be 23,74 and 73.7 according to the mediums containing DTT (I) or not (II). The molecular mass (M.W) of XO (I and II) was determined as 80.000 D. It has been found that 25°C and pH 8.0 were optimal for XO ( I and II). Km and V max of XO (I and II) were found to be 0,034 mM, 0,047 mM and 800 uM.min,813 uM.min, respectively. N-nitrosomorpholine (NMOR) showed non- competitive inhibition on the activity of XO (I and H). Following the purification XO (I) activity was not changed but XO (D) activity decreased by 29 %, in a period of 3 months at - 20°C. It has been determined that only the enzyme purified under DTT containing medium could be used for assaying SOD activity, using an appropriate co-efficient factor. In conclusion, XO purified from bovine milk, without DTT, but stored at-20°C under DTT containing medium could be used for the determination of SOD activity with tiie help of a co-efficient factor.