Kuşburnu meyvasından izole edilen polifenol oksidaz enziminin kinetik ve elektroforetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, kuşburnu meyvasından polifenol oksidaz enzimi izole edilerek, çeşitli kinetik ve elektroforetik özellikleri incelenmiştir. Bu amaçla, 8 ayrı substrat için Km ve Vmax değerlerini belirlemek üzere optimum şartlar (pH, sıcaklık ve iyonik şiddet) tesbit edildi. Optimum şartlarada 5 farklı substrat konsantrasyonunda aktivite ölçümleri yapıldı. Km değerleri katekol, 4-metil katekol, L-dopa, dopamin, gallik asit, pirogallol, L-tirozin ve p-kresol için sırasıyla 7.41x1 0`3 M, 6.06x1 0`4 M, 2.82x10-3 M, 2.64x10-3 M, 2.79x10`3 M, 8.27x10-4 M ve 8.63x10`5 M; Vmax değerleri ise aynı substratlar için 41.66, 431.96, 45.45, 42.48, 111.11, 111.73, 142.85 ve 40.00 EÜ/ml dak. olarak bulundu. Inhibitor çalışmalarında substrak olarak 4-metilkatekol kullanılarak, sodyum metabisülfit, L-sistein, askorbik asit, glutatyon, tiyoüre, sodyum azotür, sodyum dietilditiyokarbamat, ditiyoeritritol, tannik asit, benzoik asit ve p-merkaptoetanol inhibitörleri ile çalışıldı. Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla bu inhibitörler için Kj sabitleri ve inhibisyon türleri bulundu. Ayrıca I50 değerleri tesbit edildi. Kj sabitleri ve I50 değerlerine göre en etkili inhibitörün sodyum metabisülfit olduğu ve kompetetiv inhibisyon etkisi gösterdiği belirlendi. Enzimin sıcaklık artışına paralel olarak daha kısa sürede denature olduğu sıcaklığın düşürülmesi ile renatüre olduğu gözlendi. Enzim saflaştırıma işlemlerinde, jel filtrasyon kromatografisi ve iyon değişim kromatografisi ile iki pikin elde edilmesi ve tabii elektroforez ile iki bantın gözlenmesi iki izoenziminin varlığını gösterdi.

The polyphenol oxidase enzyme was extracted from doge rose fruit and its kinetic and electrophoretic features were investigated in this study. For this purpose, optimum conditions, i.e., pH, temperature and ionic strength, affecting the values of Km and Vmax for eight different substrates were determined. The assay of activites were carried out in the optimum conditions for five different concentrations of the substrate. The values of Km for catechol, 4-methyl catechol, L- dopa, dopanine, gallic acid, pyrogallol, L-tyrosine and p-Cresol are 7.41 x10`3 M, 8.46x10-3 M, 6.06x1 0'4 M, 2.82x1 0`3 M, 2.64x1 0`3 M, 2.97x1 0`3 M, 8.27x1 0-4 M, and 8.63x10-5 M. and Vmax values for the same substrates were found 4.66, 431.96, 45.45, 42.48, 111.11, 111.73, 142.85, and 40.00 EU/ml min. respectively. In inhibitor studies, 4-methyi catechol substrate was employed with sodium metabisulphite, L- cysteine ascorbic acid, glutathione thiourea, sodium azide sodium diethyl-dithiocarbamat, benzoic acid, dithioerythritol, tannic acid and 3- mercaptoethanol inhibitors for the investigation. Kj constants and the types of inhibition of these inhibitors were found by using lineweaver-Burk graphics. In addition, the values of I50 were found. Sodium metabisulfite is found to be the most effective inhibitor and to display competitive inhibition effect on the basis of the Kj constants. It was observed that the enzyme was denaturated as the temperature increased, it was renaturated as the temperature decreased. In the processes of enzyme purification, the presence of two peaks obtained with gel filtration chromatography and ion-exchange chromatography and of two bands observed from nature polyacrylamid gel electrophoresis show that there are two distinct isoenzymes of the enzyme.