İnsan lökosit myeloperoksidazının saflaştırılması

Abstract

Myeloperoksidaz (MPO), (oksidoraductaz, EC 1.11.1.7) memeli nötrofillerinin granüllerinde yer alan bir enzim olup, fagosite edilmiş bakterilerin öldürülmesinde önemli rol oynamaktadır.Buffy coattan ficoll gradiyeniti ile, EDTA'lı antikoagülanli kandan, sitratlı antikoagülanlı at kanından lökosit elde edilerek, buffy coattan CaCl2 kullanarak lökositleri yıkamasıyla, native fare 32DcI3 hücrelerinden ve lökoferez sonrası lökositlerden myeloperoksidaz (MPO) enzimi izole edilmiştir.Bu çalışmada insan myeloperoksidaz enzimini (MPO), lökosit solübilizasyonu, Con A Sepharose 4B affinite jel kromotografisi, amonyum sülfat çöktürmesi, Sephacryl S300 HR jel kromotografisi ve CM Sefhadex G 25 İyon Değiştirici kromotografi aşamaları ile saflaştırılmıştır. Bu yöntem ile H2O2 substratı kullanılarak insan myeloperoksidaz enzimi 71,45 kez saflaştırılmış ve spesifik aktivitesi 1192,574 u/mg protein olarak bulunmuştur. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile saflık derecesi kontrol edilmiş. Saflaştırılmış enzimin Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek 37 oC'de 50mM KPO4 , %0,5 CETAB tamponunda (pH: 5,4) H2O2 substratı için Km değeri 0,369 µmol ve Vm değeri 1,077 µmol/dk/mg protein olarak saptanmıştır.

Myeloperoxidase (MPO), (transmitter H2O2 oxidoreductase, EC 1.11.1.7) is an enzyme found in mammalian neutrophil granules, play an important part in killing these bacteriums fagosited.Myeloperoxidase (MPO), enzym has been isolated from leukophoresis preparations and native mouse 32Dc13 cells and using CaCl2 from buffy coats by washing up leucocyte. Leucocyte has been obtained form horse blood containing anticoagulated with citrate, anticoagulated boold with EDTA and buffy coats on a ficoll density gradient.At that study; human Myeloperoxidase (MPO) enzyme has been purified with rank of CM Sefhadex İon Exchange, Sefhacryl S300 HR Gel filtration chromatography, Con A Sepharose 4B affinity gel chromatography and adjust to 80% ammonium sulfate by the addition of dry ammonium sulfate. In our study human myeloperoxidase had a specific activity of 1192,574 units per milligram protein when H2O2 used as a substrate with a purification fold of 71,45. The purity was controlled by using SDS-PAGE. The purified enzyme had a Km value of 0,369 µmol, which was calculated from Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk plots, by using H2O2 as a substrate at the assay conditions of 370C in 50 mM KPO4 buffer (pH:5,4) containing 0,5% CETAB.