İnsan ve sığır eritrosit glutatyon redüktaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu, bazı ilaç ve kimyasal maddelerin inhibisyon veya aktivasyon etkilerinin araştırılması

Abstract

ÖZET Doktora Tezi İNSAN VE SIĞIR ERİTROSİT GLUTATYON REDÜKTAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERİZASYONU, BAZI İLAÇ VE KİMYASAL MADDELERİN İNHİBİSYON VEYA AKTİVASYON ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Mustafa ERAT Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Halis ŞAKİROĞLU Glutatyon redüktaz [Glutatyon:NADP+ oksidoredüktaz, EC 1.8.1.7; GR] enzimi, insan ve sığır eritrositlerinden saflaştırıldı. Saflaştırma; hemolizatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, afinite kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi yöntemleriyle yapıldı. İnsan ve sığır eritrosit GR enzimlerinin saflaştırılması sırasıyla %28 ve %13 verim ile 31.375 ve 4.817 kat olarak gerçekleştirildi. Sığır eritrosit GR enziminin optimal şartlan belirlendikten sonra NADPH ve GSSG substratları için Km ve Vmax değerleri hesaplandı. Jel filtrasyon kromatografisi ile enzimin mol kütlesi 118 kDa olarak bulundu. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektro forezi (SDS-PAGE) ile alt birimlerinin mol kütlesi 58 kDa olarak belirlendi. Sığır eritrosit GR enzim aktivitesi üzerine GSH ve NADP+'ın inhibisyon etkileri ve inhibisyon türleri tesbit edildi. Ayrıca, insan ve sığır eritrosit GR enzim aktiviteleri üzerine bazı ilaç ve kimyasal maddelerin etkileri araştırıldı. İnhibisyon etkisi gösteren ilaçlardan sefotaksim sodyum, sefodizim disodyum ve metronidazol için I50 değerleri ve Kj sabitleri hesaplandı. İnsan eritrosit GR için I50 değerleri sırayla l,218xl0`3 M, l,653xl0`3 M ve U35X10`4 M, sığır eritrosit GR için ise 6,052xl0`3 M, l,499xl0`3 M ve 7,566xl0`5 M olarak hesaplandı. K; sabitleri de sırayla insan eritrosit GR için 4,3 12x1 0`3 M, 3,716x1ü`4 M ve 6,995x1 0`5 M, sığır eritrosit GR için ise l,376xl0`2 M, 2,303xl0`3 M ve 1,642x1ü`4 M olarak hesaplandı. Bu üç ilaç sıçanlara uygulanarak in vivo etkileri araştırıldı ve istatistiksel olarak anlamlı inhibisyon etkileri belirlendi. 2002, 154 sayfa Anahtar kelimeler: Glutatyon redüktaz, glutatyon, sığır, sıçan, eritrosit, ilaç

ABSTRACT Ph. D. Thesis PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HUMAN AND BOVINE ERYTHROCYTES GLUTATHIONE REDUCTASE, INVESTIGATION OF INHIBITION OR ACTIVATION EFFECTS OF SOME DRUGS AND CHEMICAL MATERIALS ON THESE EZYMES Mustafa ERAT Atatürk University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Asst. Prof. Dr. Halis ŞAKİRO?LU Glutathione reductase [Glutathione :NADP+ oxidoreductase, EC 1.8.1.7; GR] enzyme was purified from human and bovine erythrocytes. The purification was performed by preparation of haemolysate, ammonium sulphate precipitation, affinity chromatography and gel filtration chromatography. Purification of human and bovine erythrocyte GR enzymes was obtained with a yield of %28 and %13, as 4.817 and 31.375 fold, respectively. Km and Vmax values for GSSG and NADPH substrates were determined after setting optimal conditions for bovine erythrocyte GR enzyme. Molecular weight of the enzyme was estimated as 1 1 8 kDa by gel filtration chromatography. Subunit molecular weight of the enzyme was estimated as 58 kDa by sodium dodecil sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Inhibition effects and kinds of NADP+ and GSH were determined on bovine erythrocyte GR enzyme activity. In addition, effects of some drugs and chemical materials were investigated on human and bovine erythrocyte GR enzymes activity. I50 values and Kj constants were calculated for cefotaxime sodium, cefodizime disodium and metronidazole from drugs showing inhibition effects. I50 values were calculated as l,218xl0`3 M, l,653xl0`3 M and 1,135x1ü`4 M for human erythrocyte GR and 6,052xl0`3 M, l,499xl0`3 M and 7,566x1 0`5 M for bovine erythrocyte GR respectively. Kj constants were found as 4,312xl0`3 M, 3,716x1ü`4 M and 6,995xl(T M for human erythrocyte GR and l,376xl0`2 M, 2,303xl0`3 M and 1,642x1ü`4 M for bovine erythrocyte GR respectively. These three drugs were administered on rats, their in vivo effects were studied and statistically significant differences in the inhibition values were found. 2002, 154 pages Key words: Glutathione reductase, glutathione, bovine, rat, erythrocyte, drug 11