İnsan ağız epitel hücresi ve insan ağız epitel hücre dizinin (KB) farklı miktarlardaki Streptococcus pyogenes`e karşı bakterisidal etkisinin ve sitokin yanıtının araştırılması

Abstract

ÖZET İnsan Ağız Epitel Hücresi ve İnsan Ağız Epitel Hücre Dizininin (KB) Farklı Miktarlardaki Streptococcus pyogenes' e Karşı Bakterisidal Etkisinin ve Sitokin Yanıtının Araştırılması insan ve hayvanlarda vücuda değişik yollardan giren mikroorganizmalar, konakta ilk önce epitel EH fiziksel bariyeri ile karşılaşmaktadır. Patojen ile EH arasındaki ilişkinin kurulması, immün yanıt oluşumuna neden olan moleküler sinyalleri doğurmaktadır. Patojen konağa girdiğinde; infeksiyondan önce var olan ve infeksiyonun ilk dakikaları içinde etkinleşen doğal savunma mekanizmaları ile karşılaşmakta, doğal konak savunmasını aşar veya doğal savunmadan kaçabilirse kazanılmış immün yanıt aktifleştirilmektedir. Ancak, konağın fazla doku hasarından korunması için toleransı etkinleştirecek mekanizmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Mukozal immün sistemde EH, özgül olmayan immün yanıttan kazanılmış immün yanıta geçişte ve immün homeostazın regülasyon veya tolerans yönünde belirlenmesinde bir kavşak noktası oluşturmakta; antijene antijenin yapısı, miktarı ve sunum şekline göre nasıl bir yanıt oluşturulacağını belirlemektedir. Çalışmamızda insan AEH ve insan ağız epitel hücre dizininin (KB hücresi) farklı miktarlardaki S. pyogenes'e verdiği yanıttaki değişimlerin incelemesi; AEH ve KB hücresinin S. pyogenes'ln farklı miktarları ile uyarımının bakterisidal etkide ve doğal immüniteye aracılık eden IL-8, kazanılmış immüniteye aracılık eden IL-6 ve toleransa aracılık eden IL-10 gibi sitokinlerin üretiminde değişikliğe neden olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma öncesinde efektör hücre olarak kullanılan AEH ve KB hücreleri ve hedef hücre olarak kullanılan S. pyogenes ATCC 19613 susu hazırlanmış; 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 E/H oranlarında plaklarda karşılaştınlmıştır. 1 ve 6 saatlik inkübasyonların ardından her bir kuyucuktaki süpernatan üremenin engellenmesi deneyi için kuyucuklardan toplanmış ve kanlı ağara ekilmiştir. 37°C'de bir gecelik inkübasyondan sonra plaklarda meydana gelen koloni oluşturan birimler sayılmış ve bakterisidal etki yüzdesi hesaplanmıştır. 1, 6 ve 24 saatlik inkübasyonlardan sonra kuyucuklardan süpernatan sitokin üretiminin ölçümü için toplanmış ve IL-6, IL-8 ve IL-10 seviyeleri ticari ELlSA kitleriyle değerlendirilmiştir. Çalışmaların istatistiksel değerlendirmesi Kruskal-Wallis testi ve multipl comparison testi ile yapılmıştır. Çalışmalar sonucunda S. pyogenes ile uyarılan AEH'nin 1. saatte ortalama %38.7, 6. saatte ortalama %54.5 ve doza bağlı baterisdal etki gösterdiği; KB hücresinin 1. saatte ortalama %36.3 ve 6. saatte ortalama %37.7 bakterisidal etki gösterdiği tespit edilmiştir. IL-6, IL-8 ve IL-10'nun yapısal olarak AEH ve KB hücresinden oluştuğu saptanmış; farklı S. pyogenes miktarları ile uyarıma bu sitokinlerin üretiminde doz ve zamana bağlı olarak değişikler olduğu gösterilmiştir. Anahtar Sözcükler: Bakterisidal etki, Epitel hücresi, IL-6, IL-8, IL-10 62

SUMMARY Evaluation of Oral Epithelial Cells and Oral Epithelial Cell Line's (KB) Bactericidal Effect and Cytokine Response Against Different Doses of S. pyogenes In humans and animals microorganisms entering to body from various routes, encounter with epithelial cell barrier firstly. Interaction of the pathogen and epithelial cells causes molecular signals followed by immune response. When pathogen enters to organism, it meets with innate immun response which exists before infection and activated at the beginig of the infection within a few minutes. If microorganism breaks innate mechanisms, adaptive immune response arises. However, protection of organism from increased tissue damage, mechanisms that activate immune tolerance is needed. Epithelial cells take role of stimulating nonspecific immune response to adaptive one on mucosal immune system. Epithelial cells have critical role at designate immune homeostasis whether as immune regulation or tolerance and according to antigen structure, dose and form of the presentation way response type will be determined. In this study it is aimed to evaluate the alteration of human oral epithelial cells and oral epithelial cell lines (KB) to different doses of S. pyogenes, at the same time the effect of the different doses of S. pyogenes on oral epithelial cells and KB cell line for bactericidal effect and differences on the production of cytokines that stimulate innate and adaptive immune response or tolerance such as IL-8, IL-6, IL-10 respectively. Before experiment, effector cells; oral epithelial cells and KB cells and target cell; S. pyogenes ATCC 19613 strain were prepared. The cells were stimulated with bacteria in plates with an effector cell / target cell ratio of 1/1, 1/100, 1/1000 and 1/10000. At the end of 1 and 6 hours incubation, supernatants were collected from each wells for growth inhibition assay and were inoculated onto blood agar plates. Following overnight incubation at 37°C, colony forming units were enumareted and bactericidal effects were calculated. At the end of 1, 6 and 24 hours incubation, supernatants were collected from each wells for measurment of cytokine production, and IL-6, IL-8, IL-10 levels were measured with commercial ELİSA kits. Kruskal-Wallis test and multiple comparison test were used for statistical analysis. Oral epithelial cells stimulated with S. pyogenes showed dose dependent bactericidal effect, calculated mean value for bactericidal effects were 38.7% at the end of 1 hour incubation, 54.5% at the end of 6 hours incubation. Calculated mean value for bactericidal effects on KB cells stimulated with S. pyogenes were 36.3% at the end of 1 hour incubation, 37.7% at the end of 6 hours incubation. It's determined that IL-6, IL-8 and IL-10 were produced by each oral epithelial cells and KB cells and induction of these cells with different doses of S. pyogenes represent a dose and time dependent manner in cytokine production. 63Keywords: Bactericidal effect, Epithelial cells, IL-6, IL-8, IL-10 64