Isırgan otu yaprak ve tohumlarının besleyici özellikleri ve antitümörel etkileri

Abstract

?170- ÖZET ülkemizde Karadeniz ve Doğu Anadolu Bölgesi halkınca sebze olarak tüketilen ısırgan otu [UnticM. dioica L.) halk tıbbında kanser dahil bir çok hastalığın sağaltımı amacı ile de kullanılmaktadır. Ancak, sağaltıcı etkilerinin geçerliliği bilimsel deneylerden çok, gözlem ve folklora dayanmaktadır. Çağdaş literatürde, antitümörel etkinliğini doğrudan destekleyen bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışma, Türkiye'de yetişen ısırgan otu yaprak, çiçek ve tohumlarının besleyici özelliklerini belirlemek, bunun yanında miyeloma hücreleri ve bunların oluşturduğu tümörler üzerinde etkilerini sistematik olarak incelemek amacıyla ele alınmıştır. Besleyici özelliklerinin belirlenmesi kapsamında, yaprak, çiçek ve tohumların kuru madde, yağ, protein, karbonhidrat, sellüloz, kül, C vitamini, g-karoten, a-tokoferol, tiamin, riboflavin, niasın, B6 vitamini, demir, çinko, bakır, kalsiyum, fosfor, magnezyum, manganez, sodyum, potasyum ve selenyum düzeyleri saptanmıştır. Yaprak, çiçek ve tohumlardan elde edilen proteinlerin amino asit bileşimleri belirlenmiş, en çok sınırlayıcı elzem amino asitleri olarak ortaya çıkan kükürtlü amino asitlere (metionin ve sistin) göre kimyasal puanları ve gerçek protein değerleri hesaplanmıştır. Tohumdan elde edilen yağın, yağ asitleri bileşimi saptanmıştır. Fare deneylerinde, BALB/c fareleri, doğumdan sonraki 4. hafta içinde anne sütünden kesilerek denemeye alınmışlardır. Hayvanlarda miyeloma tümörleri, doğumdan 6-8 hafta sonra bağışıklık bastına bir madde olan `pristane`, bundan 7-10 gün sonra da fare miyeloma hücreleri peri--171- tona enjekte edilerek oluşturulmuştur. Deneyler dört etapta yürütülmüştür. Birinci etapta, fare diyeti ne #15 oranında katılan sade tohum ve tohum+bal ile içme suyu yerine balla birlikte verilen yaprakların %5'lik su ekstresinin miyeloma tümörleri üzerinde koruyucu, engelleyici ve sağaltıcı etkileri araştırılmıştır. İkinci etapta, sade tohum ve tohum+bal deneyleri tekrarlanmış, ancak yaprakların su ekstresi yerine tohumun su ekstresi denenmiştir, ö- çüncü etapta, hayvanlara peritonal enjeksiyonla verilen tohumun sulu alkol ekstresinin (3,2 ve 6,4 mg/kg fare), engelleyici ve sağaltıcı et kileri incelenmiştir. Dördüncü etapta, tohumun sulu alkol ekstresinin hidroliz edilmesi ile saflaştırılan ürünün (0,46 mg/kg fare) dil üzeri ne fışkırtılarak ağız yoluyla verilmesinin miyeloma tümörlerini engelleyici ve çeşitli dokularda yayılmalarını önleyici etkileri denenmiştir. Antitümörel ve toksik etkinlik parametreleri olarak; ağırlık değişimi, ölüm oranı, histopatolojik bulgular ve deneyler sürecinde yapılan göz lemler kullanılmıştır. Verilerin değerlendirilmesinde, tesadüf parsellerine göre variyans analizleri, t-istatistikleri ve x2 -testleri kullanılmıştır. Birbirine bağlı değişik aşamalarda yürütülen saflaştırma çalışmalarında ilk önce, yaprak, çiçek ve tohumların su ekstrelerinin hücre kül türünde miyeloma hücreleri üzerinde aktiviteleri saptanmıştır. Ardından, tohumun sulu alkol ve aseton ekstrelerinin, susuz alkol ve aseton ekstrelerinin hidroliz ürünlerinin ve bunların kromatografi fraksiyonlarının aktiviteleri belirlenmiştir. Aktivite gösteren kısımların saflık düzeyleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi yöntemleriyle incelenmiş, kimyasal içeriklerinin, ultra viyole infraruj ve nükleer manyetik resonans teknikleriyle tanımlanmasına çalışılmıştır.?172- Besin öğesi analizleri sonucunda, Türkiye'de yetişen ısırgın otu tohumunun yüksek düzeyde yağ (%24,98) ve protein (%21,85) içerdiği bulunmuştur. Tohumun, gerçek protein değeri (%15,51) ve kimyasal puanı (%86,6) ile diğer bitkilere kıyasla üstün bir protein kalitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Tohum yağının yağ asitleri bileşimleri, %59,34 oranında linoleik asit düzeyi ile ayçiçek yağına benzer bir tablo sergilemiştir. Tohum, ayrıca, yüksek selenyum içeriğiyle (0,078 mg/100 gr) de dikkat çekmektedir. Kurutulmuş çiçeklerin sellüloz (3514,80), kül (%14,96) a-tokoferol (16,9 mg/100 gr), riboflavin (0,76 mg/100 gr), demir (43 mg/100 gr), çinko (2,60 mg/100 gr), kalsiyum (2978 mg/100 gr), fosfor (400 mg/100 gr) ve potasyum (1492 mg/100 gr) yönünden zengin olduğu saptanmıştır. Kuruma esnasında, C vitamininin kaybolduğu, B-karoten aktivitesinin (1900 yg/100 gr) ise azaldığı anlaşılmıştır. Doğada bol miktarda bulunan taze yaprakların üstün besleyici özellikleri olduğu belirlenmiştir. Protein içeriği (%6,47), 1 izin düzeyi (5,53 gr/100 gr protein) ve gerçek protein değeri (X3.14) açısından yenebilen diğer yeşil yapraklı bitkilere kıyasla farklılık göstermektedir. Ayrıca bazı önemli vitaminler için de en iyi kaynaklardan biri olduğu da belirlenmiştir. Araştırmamızda, 100 gram yaprakta, 237 mg C vitamini, 5000 jjg B-karoten, 14,4 mg a-tokoferol, 0,015 mg tiamin, 0,23 mg riboflavin 0,62 mg niasin ve 0,068 mg B6 vitamini bulunmuştur. Yapraklar minerallerce de çok zengindir; 100 gramında, 13 mg demir, 0,95 mg çinko, 0,52 mg bakır, 853 mg kalsiyum, 75 mg fosfor, 96 mg magnezyum, 3 mg manganez, 16 mg sodyum, 532 mg potasyum ve 0,0027 mg selen yum saptanmıştır. Araştırmada, ısırgan otunun antitümörel etkilerinin, incelendiği in vivo deneyler kapsamında, tüm etaplarda farelerde ağırlık değişimi-173- ile tümör oluşumu ve dokulara yayılışı arasında bir ilişki bulunamamıştır. Bu durum, tümörlü farelerdeki doku kaybının, miyeloma tablosuyla ortaya çıkan ağır ödemle karşılanmasından kaynaklanmıştır. Birinci ve ikinci etaplarda, diyetle verilen sade ve ballı tohumun, farelerde önemli düzeylerde koruyucu, engelleyici ve sağaltıcı etki gösterdikleri bulunmuştur. Tohumun balla birlikte verilmesi bir dereceye kadar daha etkili olmuştur. Yaprak ekstreli ballı su, tümör oluşumunu önlemede önemli ölçüde; oluşan tümörlerin iyileştirilmesin de ise çok daha düşük düzeyde etkinlik göstermiştir. Erkeklerde ölüm oranı daha yüksek bulunmuştur. Bunun yanında, inhibisyon oranının er kek ve dişilerde eşit olduğu saptanmıştır. Bu etaplarda denenen farelerin hiç birinde toksik etki gözlenmemiştir. üçüncü etap deneylerinde, sulu alkol ekstresinin hayvanlara enjeksiyonla verilmesinin toksik etki yaptığı, gerek deney süresince yapılan gözlemler gerekse histopatolojik incelemeler sonucu ortaya çıkmıştır. Ayrıca, toksik etkinin, hücre verilen hayvanlarda daha kuvvetli olduğu; özellikle hücre enjeksiyonundan hemen sonra ekstre enjekte edilen `engelleyici etki` grubunda, öldürücü düzeylere eriştiği belirlenmiştir. Dördüncü etap deneyleri sonucunda, ağız yoluyla verilen hidroliz ürününün, miyeloma tümörlerini, karaciğer dokusunda %74, pankreasta %76 ve bağırsakta %81 oranında engellediği saptanmıştır. Her üç dokuda da, tümör oluşum düzeyi erkeklerde daha yüksek bulunmuştur. Bunun yanında, inhibisyon düzeyinin, karaciğer ve bağırsak dokularında erkeklerde, pankreasta dişilerde daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu etapta hidroliz ürünü verilen hayvanlarda toksik etkiye rastlanmamıştır. Tohum, kurutulmuş çiçek ve yaprakların su ekstrelerinın in vitro ortamdaki aktivitelerinin incelendiği hücre kültürü deneylerinin ilk a--174- şamasmında, tohum ekstreleri, özellikle kaynatılarak ve otoklav yapılarak elde edilenler, önemli düzeyde aktivite (%85-95) göstermişlerdir. Yapraklarda daha az aktivite gözlenirken (%20-45), kurutulmuş çiçekler de aktivite saptanmamıştır. Tohumların sulu ekstreleri organik çözücülerle çöktürülerek temizlendiğinde, aktivitenin %100*e çıktığı izlenmiştir. Bu ekstrelere uygulanan kromatografiler sonucu aktif maddenin su ve alkol karışımları ile alınabildiği belirlenmesi üzerine, tohumlardan doğrudan elde edilen sulu alkol ve aseton ekstreleri hücre kül türünde denenmiş ve 10 mg/ml konsantrasyonda %100 aktivite gösterdikleri saptanmıştır. Saf alkol ve aseton ekstrelerinin aktivitelerı daha düşük bulunmuştur. Labil olduğu saptanan aktif maddeyi korumak amacı ile değişik antioksidanlar denenmiş, ancak etkili olmadıkları belirlenmiştir. Bundan sonraki aşamalarda, saflaştırma çalışmaları vakumlu kromatografi yöntemleri kullanılarak yürütülmüştür. Kromatografi Terden elde edilen %10 sulu metanol fraksiyonunun, hücreler üzerinde 0,8 mg/ml konsantrasyonda %100; 0,4 mg/ml konsantrasyonda %50 aktivite göster dikleri saptanmıştır. Sulu alkol ekstresi, hidroliz edilerek şekerler den arındırıldığında, hücreler üzerinde, 0,1 mg/ml konsantrasyonda, 100% aktivite göstermiştir. Bundan sonraki saflaştırma çalışmalarına, farklı çözücü karışımlarının kullanıldığı ince tabaka kromatografisiyle devam edilmiştir. Bu aşamada, aktif maddenin bulunduğu fraksiyonun sadece iki bileşik içerecek düzeyde saflaştırıldığı sanılmaktadır. Yukarıda verilen değişik aşamalarda saflaştırılmasına çalışılan fraksiyonların kimyasal içeriklerinin tanımlanması amacıyla uygulanan UV, İR, NMR ve element analizleri sonuçları, aktif maddenin, tohumlarda glikozit olarak bulunan, polar bir alkaloit olabileceğine işaret etmiştir.

.175- SUMMARY ASSESSMENT OF THE NUTRITIONAL PROPERTIES AND ANTITUMOURAL ACTIVITY OF THE COMMON NETTLE GROWN IN TURKEY The common nettle {Untica dloica L. ) is consumed widely as a vegetable by people of the Northern and Eastern Anatolian regions of Turkey and used in folk medicine as a panacea for the treatment of many ailments including cancer. Its remedial abilities, however, are based on folklore rather than scientific evidence and clinical observations. There is no work in the current literature that supports directly the claimed antitumoural activities of the plant. This work was undertaken to assess the nutritional properties of the leaves, flowers and seeds of the plant and also to investigate systematically their in vivo and in vitro activities on myeloma cells and neoplasms. For the assessment of the nutritional value of the plant, analy ses vere carried out to determine the dry matter, fat, protein, carbohyd rate, cellulose, ash, vitamin and mineral contents of the leaves, dried flowers and seeds. Amino acid profiles of the proteins were determined and their chemical scores and real protein values calculated with res pect to the sulphur containing amino acids, methionine and cysteine, which were found to be the first limiting amino acids. The oil from the seed was analysed to ascertain its fatty acid composition.-176- In vivo mouse assays were carried out to assess the antitumoural activity of the common nettle on myeloma tumours. BALB/c mice were weaned and taken into trial in the 4th week following their birth. Mye loma tumours were induced by peritonal injection of the immune suppres sive agent `pristane` between the 6th and 8th week after birth and sub sequent peritonal injection of mouse myeloma cells 7 to 10 days later. The assays were conducted in four trials. In the first, the pro tective, preventive and curative effects of incorporating the seed (as is and with honey) as 15% of the daily diet of the animals was examined. In the same trial, the effect of giving the 5% water extract of the leaves as the animals drinking water was also investigated. The second trial was a repetition of the first except for the replacement of leaf extracts by seed extracts. In the third trial, the preventive and curative effects of the peritonal injection of aqueous alcohol extract of the seeds (3.2 and 6,.4mg/kg bw) were determined. The fourth was carried out to test the preventive effect of the orally administered hydrolyses product of the aqueous alcohol extract (0.46mg/kg bw) on the progres sion of myeloma tumours in various organ tissues. The parameters used for evaluating the antitumoural activities and toxic effects of the plant were weight change, mortality rate, histopathological data and physical examinations carried out during the course of the trials. For evaluation of the data, variance analyses according to random sampling, t-statistics and x2-tests were used. For the purification and isolation studies, activities of the leaves, dried flowers and seeds on myeloma cells were determined using in vitro cell culture techniques. Initially, activities of the water ex tracts of the leaves, flowers and seeds were investigated. In the light-177- of the results of the above experiments, subsequent work was concerned with studies of the activity of the seeds only. Antitumoural activities of aqueous alcohol and acetone extracts.pure alcohol and acetone extracts, hydrolyses products of aqueous alcohol extracts and different fractions obtained from their chromatographic separations were then de termined. The purification levels of the different fractions were inves tigated by HPLC and TLC analyses. For the identification of the chemical structures of the active fraction components,UV,IR and NMR spectrosco pic techniques were employed. Nutritional analyses of the common nettle grown in Turkey showed that the seeds had a high fat (24.98%) and protein (21.85%) content. The protein quality of the seed, as displayed by its chemical score (86.6%) and real protein value (15. 51%), is well above average when compared with other plants. The fatty acid composition of the seeds with respect to its high linoleic acid content is similar to that of sunflower seeds- In the seeds selenium is also present in high levels (0.078mg/100g). The dried flowers were found to be rich in celulose (14. 80%), ash (14.96%), a-tocopherol (16.9mg/100g), riboflavin (0.76mg/100g), iron (43mg/100g),zinc (2.60mg/100g),calcium(2978mg/100g), phosphorus (400mg/ 100g) and potassium fl492mg/100g). The analyses showed that as a result of the drying process, total loss of vitamin C and a substantial de crease in ^carotene activity(1900pg/100g) were incurred. The naturally abundant fresh leaves possess exceptipnal nutri tional properties. With respect to their protein (6.47%) and lysine(5.53 g/100g protein) contents and real protein value (3.14%), the nettle leaves offer a higher protein quality than all other known greens used as vegetables. They are one of the. best natural sources of a-tocopherol.178- (14.4mg/100g) vitamin C (237mg/100g),g -carotene ( 5000jjg/100g) and ribo flavin (0.23mg/100g). Also, 100 grams of leaves were found to contain 0.01 5mg thiamin, 0.62mg niacin and 0.068mg vitamin B. Nutrient analyses 6 showed them to be rich in minerals as well; 100 grams of leaves were found to contain 13mg iron,0.9mg zinc,0.52mg copper, 853mg calcium, 75mg phosphorus, 96mg magnesium, 3mg manganese, 16mg sodium, 532mg potassium and 0.0027mg selenium. In all the four trials conducted for the animal studies, no relationship could be found between the weight changes observed in mice and the incidence and progression of myeloma tumours. This was found to be due to the tissue loss, expected as a result of neoplasms, being compensated by intense oedema appearing as part of the myeloma profile. The results of the first and second animal trials showed that the seeds given with or without honey as part of the animals diet had significant protective (84% i nhi bit i on), pre vent ive (95% inhibition) and curative (62.5% inhibition) activity. Giving the seed together with hon ey was found to display a slightly but not significantly higher inhibi tory activity than giving it without honey. Water extract of the leaves with honey showed a high protective and preventive but low curative activity. Mortality rate was higher in males; on the other hand, the level of inhibition was the same in males and females (81.5%). In these two trials, no toxic effects were observed in the experimental animals. Both physical and histopathological examinations of the animals in the third trial showed that the peritonal injection of the aqueous alcohol extract of the seeds had toxic effects on mice. It was found that toxicity was more pronounced in animals treated with myeloma cell injections and that it reached lethal levels in the `preventive effect`?179- group animals which were given extract injections soon after (24 hours later) myeloma injections. As a result of the 4th trial experiments, the orally adminis tered hydrolysis product was shown to inhibit the development of mye loma tumours in the liver by 74%, in the pancreas by 76% and in the in testine by 81%. In all of three organ tissues, neoplastic progression was higher in males although inhibition of tumours in liver and pan creatic tissues was also higher in males. No toxic effects were detected in the experimental animals used in this trial. As a first step in the in vitro determination of the antitumoural activities of the common nettle, water extracts of the leaves, dried flowers and seeds were analyzed for activity in myeloma cell culture. The water extracts of the seeds.especially those obtained by boiling or autoclaving, showed high activity (85-95%). The activity of the leaves was lower (20-25%) and the dried leaves did not show any activity at all. When the water extracts of the seeds were clarified by precipita tion with water miscible organic solvents, the activity was found to rise to 100%.Application of colon chromatography showed that the active component could be e luted with water-alcohol mixtures; consequently, extractions were then carried out directly with aqueous alcohol solvents. These extracts displayed 100% activity at 10mg/ml concentrations in the cell culture medium. Activities of the pure alcohol and acetone extracts were found to be lower. In order to protect the active component, which appeared to be a labile compound,the use of several antioxidants was investigated but no beneficial effect on the stability of the activity was found. The puri fication operations were then continued using chromatographic proce-180- dures under vacuum. The 10% aqueous methanol fraction obtained from vacuum chromatography showed 100% activity at 0.8mg/ml concentrations and 50% activity at 0.4mg/ml concentrations in the cell culture media. When the sugars were discarded from the aqueous alcohol extract by acid hydrolysis, the product mixture showed 100% activity at 0.1mg/ml con centrations in the cell culture. The subsequent purification work was carried out by TLC using various solvent mixtures. In the light of chromatographic evidence, the active fraction at this stage, appears to contain two compounds only. The results of the UV, IR and NMR analyses so far indicate the active compound to be a polar and elusive alkaloid possibly existing as its glycoside in the seeds.