Glutatyon S-transferaz enziminin gökkuşağı alabalık (Oncorhynchus mykiss) eritrositlerinden saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı kimyasalların etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, gökkuşağı alabalığı eritrositlerinden glutatyon S-transferaz (E.C 1.8.1.7.; GST) enzimi glutatyon-agaroz afinite kromatografisi kullanılarak 16,54 EÜ x mg-1 protein spesifik aktiviteyle ve %59 verimle 11.026 kat saflaştırıldı.Saflaştırılan enzimin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini belirlemek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant elde edildi. Alt birim molekül kütlesi yaklaşık 23 kDa olarak belirlendi. Eritrosit GST enziminin tabii halinin molekül kütlesi Sephadex-G 100 jel filtrasyon kolonu kullanılarak yaklaşık 47 kDa olduğu tespit edildi. Eritrositlerden saflaştırılan GST için optimum iyonik şiddet 10 mM K-fosfat tamponu olarak belirlendi. Enzim için optimum pH, stabil pH ve optimum sıcaklık sırasıyla 7,3, 7,3, 300C olarak bulundu. Saf enzimin KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden faydalanılarak GSH substratı için KM 0,0395, Vmax 0,0328 EÜ/ml; CDNB substratı için KM 0,259, Vmax 0,0655 EÜ/ml olarak hesaplandı. Saflaştırılan GST enzimi üzerine in vitro inhibisyon etkisi gösteren sefuroksim sodyum, gentamisin sülfat, amikasin sülfat antibiyotikleri ve Ag+, Cd+2, Cr+2 ve Mg+2 metal iyonları için IC50 değerleri ve Ki sabitleri hesaplanarak inhibisyon tipleri belirlendi.

In the present study, Glutathione S-transferase (E.C 1.8.1.7.; GST) enzyme was purified from rainbow trout (RT) erythrocyte a specific activity of 16,54 and a yield of 38% and 11026-fold respectively using glutathione-agarose affinity gel chromatography. To check the purity of the purified enzyme and to determine the subunit molecular masses of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed and a single band was obtained and Mw of approx. 23 kDa for eritrochyte. The molecular weight of native of erythrocyte GST enzyme was estimated to be approx. 47 kDa by Sephadex-G 100 gel filtration chromatography, respectively. Optimum ionic strengths for the GST from erythrocyte were obtained as 10 mM K-Phosphate buffer. Optimal pH, stable pH, optimal temperature were determined as 7,3, 7,3, 300C respectively, Also KM and Vmax values were determined for enzyme; KM for GSH subsrate: KM 0,0395, Vmax for GSH subsrate: 0,0328 EÜ/ml; KM for CDNB subsrate: 0,259, Vmax for CDNB subsrate: 0,0655 EÜ/ml. After that, in vitro inhibitory effects of some antibiotics, including cefuroxime sodium, gentamicine sulfate, amikacin sulfate and some metal ions, incorporating Ag+, Cd+2, Cr+2 and Mg+2 were evaluated. IC50 values and Ki constants of corresponding antibiotics and metal ions were calculated, and inhibition types were determined.