Hematolojik malignansilerde P-glikoprotein ekspresyonunun RT-PCR ile tayin edilmesi

Abstract

ÖZET Tümör hücrelerinde kemoterapötik ilaçlara karşı direnç gelişmesine yol açarak tedaviyi başarısız kılan nedenlerden biri çoklu ilaç direnci (Multidrug resistance, MDR) dir. Hücresel çoklu ilaç direncinde önemli nedenlerden birincisi hücre zarında yerleşen ve genellikle lipofilik yapıdaki ilaçların hücre içinde birikmesini önleyen P-glikoproteinin (P-gp) dir. Bu nedenle, P-gp ekspresyonu hücresel çoklu ilaç direnci ile yakından ilişkilidir. P-gp'i MDR1 geni kodlar. P-gp ekspresyonu hematolojik malignansilerde kemoterapi öncesinde ve sonrasında görülebilmektedir. Ancak, kemoterapi sonrasında arttığı bildirilmektedir. Total hücresel RNA kullanılarak `reverse transcription` polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile P-gp ekspresyonu tayin edilebilmektedir. Bu çalışmada, Hacettepe Üniversitesi Onkoloji Hastanesi Polikliniklerine başvurarak, akut lösemi tanısı alan 28 hastadan ve kemik iliği tutulumu olmayan 10 hastadan alınan periferik kan veya kemik iliği örnekleri kullanıldı. Bu örneklerden izole edilen total hücresel mRNA'lar RT-PCR yöntemi ile çalışılarak P-gp ekspresyonu araştırıldı. mRNA'lardan `reverse transcription` yolu ile cDNA elde edildi. cDNA polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltıldıktan sonra % 2 lik agaroz jel elektroforezini takiben ultraviyole transilluminatörde incelendi. Hasta örneklerinden 12'sinde 167 bp'e karşılık gelen P-gp ekspresyonuna özgün band tespit edildi. P-gp ekspresyonunun pozitif olması çoklu ilaç direncinin pozitif olması olarak kabul edildi. Çalışmamızda, 20 akut myelositik lösemi (AML) hastasının 10'unda (%50), 8 akut Ienfositik lösemi (ALL) hastasının ise 2'sinde (%25) P-gp ekspresyonu tespit edildi. P-gp ekspresyonu, AML hasta örneklerinden yeni tanı alanlarda %35.7, kemoterapi alanlarda ise %83.3 olarak tespit edildi. Bu sonuçların, Fisher kesin khi-kare testi ile istatistiksel analizi yapıldı. AML hastalarında P-gp ekspresyonu ile kemoterapi arasında istatistiksel olarak sınırda anlamlı bir ilişki olduğu görüldü (P=0.0704). ALL hastalarında ise P- gp ekspresyonu yeni tanı alanlarda %0, kemoterapi alanlarda ise %50 olarak tespit edildi. Buna göre, ALL hastalarında P-gp ekspresyonu ile kemoterapi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunamadı (P =0.2143). Sonuç olarak, hematolojik malignansilerde kemoterapi ile P-gp ekspresyonu arasında anlamlı bir ilişki bulunmuştur. MDR' de önemli bir parametre olan P-gp ekspresyonunun hematolojik malignansilerde rutin olarak tayininin tedavi planlamasında katkısı olabilir. Bu amaçla kullanılabilecek en uygun yöntemlerden biri RT-PCR dır. Anahtar kelimeler : çoklu ilaç direnci, AML, ALL, P-glikoprotein polimeraz zincir reaksiyonu, iv

ABSTRACT In tumor cells, one of the major reasons leading to treatment failure by developing resistance to chemotherapeutic drugs is multidrug resistance (MDR). P-glycoprotein (P-gp) expression in the cell membrane usually leading to decreased intracellular accumulation of lipophilic drugs in the cell is the major factor in the cellular MDR. For this reason, P-gp expression has a close relation with cellular multidrug resistance. P-glycoprotein is encoded by MDR1 gene. P-gp expression has been frequently observed in hematological malignancy before and after chemotherapy. P-gp expression has been observed to increase after chemotherapy. P-gp expression can be detected by using cellular mRNA with `reverse transcription` polymerase chain reaction (RT-PCR) method in clinical sample. In this study, peripheral blood or bone marrow specimens obtained from 28 patients diagnosed with acute leukemia in Oncology Hospital of the Hacettepe University and 10 control patients with no disease in the bone marrow were analyzed. mRNA specimens isolated from the blast cells were studied with RT-PCR and P-gp expression was detected. cDNA were synthesized from mRNA by the way of `Reverse Transcription` and amplified with PCR. Amplified cDNA were then run away on 2% agarose gels electrophoresis and band corresponding to 167 bp segment that is specific for P-gp expression were seen by ultraviolet transilluminator. P-gp expression was detected in 12 samples declaring the existence of multidrug resistance The band specific for P-gp expression has been detected in 10 of 20 samples (50%) of acute myelocytic leukemia (AML) patients and 2 of 8 samples (25%) of acute lymphocytic leukemia (ALL) patients. P-gp expression has been detected in 16.7% of untreated AML patients and 83.3% of treated AML patients. These results were statistically analyzed by Fisher's Exact Test. According to this test, there was a marginally significant relation between P-gp expression and chemotherapy in AML patients (P=0.0704). On the other hand, this relation was insignificant in ALL patients (P=0.2143). Consequently, we observed that there is a significant relation between chemotherapy and P-gp expression in hematological malignancy. P-gp expression is the main parameter for MDR and regular detection of P-gp in hematological malignancy will be of benefit to the treatment protocols. RT- PCR is one of the most useful methods for this purpose. Key words: multidrug resistance, AML, ALL, P-glycoprotein polymerase chain reaction