Afinite kromatografisi tekniği ile peroksidaz enziminin kırmızı pancardan (Beta vulgaris) saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzohidrazit afinite kolonu hazırlanarak kırmızı pancar (Beta vulgaris) bitkisinden peroksidaz (POD) enzimi tek basamakta %38 verimle 196,9 kat saflaştırıldı. Kromatografik işlemler sırasında enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak 470 nm'de ölçüldü. Saflaştırılan POD enziminin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini belirlemek için SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Molekül kütlesi kırmızı pancar (Beta vulgaris) POD 160 kDa bulundu. Saflaştırılan POD enzimi üzerine yapılan kinetik çalışmalar neticesinde optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH sırasıyla 6,5, 0,7 M, 70ºC, 6,5 olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için enzimin KM ve Vmax değerleri hesaplandı ve kırmızı pancar (Beta vulgaris) için KM 9,09 mM ve Vmax 1,3812 EÜ/ml olarak belirlendi. Peroksidaz enzimi üzerine 4-aminobenzohidrazit inhibitörünün inhibisyon etkisi in vitro şartlarda incelendi. 4-aminobenzohidrazit inhibitörü peroksidaz için yarışmasız inhibisyon göstermekte olup IC50 değeri 0,047 mM olarak, Ki değeri ise 0,777±0,17 mM olarak tespit edildi.Anahtar Kelimeler: Peroksidaz, saflaştırma, afinite, karakterizasyon

In this study, peroxidase (POD) enzymes of red beet (Beta vulgaris) plant were purified in a single step by using Sepharose-4B-L-tyrosine-4-aminobenzohydrazide affinity chromatography as 38% yield, 196.9-fold. Enzyme activity was measured spectrophotometrically at 470 nm. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed to check the purity and molecular weights of enzymes to determine and the observed single band. Molecular masses of enzymes for POD red beet (Beta vulgaris) was found to be approximately 160 kDa. As a result of the kinetic studies on the enzyme; optimum pH, optimum ionic strength, the optimum temperature and stable pH were determined as 6.5, 0.7 M, 70ºC, 6.5 for red beet (Beta vulgaris). KM and Vmax values were calculated for the pure enzyme using guaiacol as substrate and for red beet (Beta vulgaris) KM and Vmax values were found to be as 9.09 mM and 1.3812 EU / ml. Also, inhibitory effect of 4-aminobenzohydrazide inhibitor on pure peroxidase enzyme was examined in vitro condition. 4-aminobenzohydrazide have shown noncompetitive inhibition in peroxidase enzyme of red beet (Beta vulgaris), IC50 value was calculated as 0.047 mM, Ki value was calculated as 0,777±0,17 mM.Keywords: Peroxidase, purification, affinity, characterization