Organosfatlara maruziyet sonrasında oluşan protein eklenti ürünlerini tanıyan monoklonal antikorun karakterizasyonu

Abstract

Organofosfat (OP) pestisitler, kolinesterazların [asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE)] tersinmez inhibitörüdür. OP'ler, akut toksik etkisini AChE'nin aktif bölgesindeki serin amino asidine kovalent bağlanarak göstermektedir. Aktif bölgede serin içermeyen proteinler (örneğin albümin) ise, tirozin ve lizin amino asitlerinden OP bileşikler ile kovalent olarak modifiye edilmektedir. OP'lerin tirozin amino asidi ile yaptığı kovalent bağ, serin ile yaptığı kovalent bağa göre daha stabildir. AChE ve BChE inhibisyonu, OP pestisitlere maruziyet sonrasında ortaya çıkan kronik hastalıkların nedenini açıklayamamaktadır. Kronik OP toksisitesinin nedeninin aydınlatabilmesi için yeni biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yeni biyobelirteçlerin belirlenmesinde kullanılmak üzere tirozine bağlı protein eklenti ürünlerini tanıyan bir monoklonal antikor tasarlamak ve karakterize etmektir. Çalışmada, farklı amino asit dizilerine sahip dietoksifosfotirozin peptitleri sentezlenip 4 farklı taşıyıcı proteine konjuge edildi. Konjuge proteinler kullanılarak hibridoma teknolojisi ile depY olarak isimlendirilen monoklonal antikor üretildi. DepY antikoru saflaştırıldı ve bağlanma afinitesi ve özgüllüğünü belirlemek için ELISA, Western Blot, Biocore, Octet teknolojisi ile karakterize edildi. Sonuçlar, depY antikorun, amino asit dizisinden bağımsız olarak sadece dietoksifosfotirozin modifiye protein ve peptitleri tanıdığını gösterdi. Ayrıca HEK293 hücre lizatları, klorprifos okson ile muamele edildi. Triptik peptitler, depY-Sefaroz reçine ile saflaştırılıp kütle spektrometri ile analiz edildiğinde; 73 proteine ait 116 dietoksifosfotirozin modifiye peptit tanımlandı. Sonuç olarak, depY monoklonal antikoru, OP maruziyetinin yeni biyobelirteçlerinin tanımlanmasında ve herhangi bir türdeki dietoksifosfotirozin modifiye proteinlerin belirlenmesinde yararlı olacaktır.

Organophosphorus (OP) pesticides are irreversible inhibitors of cholinesterases [acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE)]. The OPs cause the acute toxic effect by covalent binding to a serine amino acid in the active site of AChE. Proteins that have no active site serine, such as albumin, are covalently modified by OPs on tyrosine and lysine. The covalent bond of OP compounds with tyrosine is more stable than with serine. Chronic illness from OP pesticides exposure is not explained by inhibition of AChE and BChE. New biomarkers are needed to elucidate the cause of chronic toxicity. The goal of this study was to design and characterize monoclonal antibody that recognizes protein adducts on tyrosine that would be useful in the identification of new biomarkers. Various diethoxyphosphate-tyrosine peptides were synthesized and cross-linked to 4 different carrier proteins. Monoclonal antibody called as depY were produced with hybridoma technology using the conjugated proteins. DepY antibody was purified and characterized by ELISA, Western Blot, Biocore, Octet technology to determine binding affinity and binding specificity. The results showed that depY recognizes diethoxyphospho-tyrosine modified proteins and peptides independent of the surrounding amino acid sequence. Furthermore, HEK293 cell lysates were treated with chlorpyrifos oxon. When tryptic peptides immunopurified with depY-Sepharose were analyzed by mass spectrometry, 116 diethoxyphosphate-tyrosine modified peptides from 73 proteins were identified. Consequently, the use of depY monoclonal antibody could be useful for identifying novel biomarkers of OP exposure and for analyzing modified proteins in any species.