Sülfanilamid türevleri kullanılarak memeli sütlerinden laktoperoksidaz enziminin saflaştırılması

Abstract

Laktoperoksidaz (LPO E.C.1.11.1.7) enziminin farklı memeli sütlerinden saflaştırılmasında sülfanilamid türevi olan 5-amino-2-metilbenzensülfonamid, 2-amino-5-metil-1,3-benzendisülfonamid, 3,5-diklorosülfanilamid, sulfisomidin, sulfadiazin, sulfamerazin, sulfametazin, sulfisokzol, sulfasetamid, sulfametoksipiridazin ve sulfaguanidin moleküllerinin kullanılabilirliliği araştırılmıştır. Bu amaçla önceden saflaştırılan sığır LPO enzimi kullanılarak moleküllerin kinetik parametreleri belirlenmiştir. Enzimin aktivitesini yarıya düşüren inhibitör konsantrasyonu (IC50) değeri herbir molekül için sırasıyla 0,693, 115,00, 346,50, 173,00, 92,24, 309,00, 346,50, 221,70, 3,44, 173,20 ve 17,15 µM olarak hesaplanırken Ki değerleri ise sırasıyla 0,0004, 16,37, 103,32, 122,00, 90,66, 78,00, 198,00, 182,66, 870,00, 56,30 ve 1,24 µM olarak tespit edildi. Dönüşümlü inhibisyon gösteren bu moleküllerin her biri için afinite jeli sentezlenerek sığır, koyun, manda ve keçi sütü LPO enzimi için saflaştırma tabloları hazırlandı. Saflaştırma basamakları sonucunda moleküller arasında kullanılma potansiyeli en yüksek olan 5-amino-2-metilbenzensülfonamid molekülü ile sığır sütünden LPO enzimi tek basamakta %82,68 verimle, 1059,37 kat, manda sütünden %34,67 verimle, 509,09 kat, koyun sütünden %14,35 verimle, 232,55 kat ve keçi sütünden ise %11,30 verimle, 161,90 kat saflıkta elde edilmiştir. Enzimlerin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve yaklaşık 80 kDa'lık tek bant bulundu. 5-amino-2-metil benzensülfonamid kolonundan saflaştırılan sığır LPO için optimum pH 6,0; optimum sıcaklık 45°C; Km değeri 0,15 mM ve Vmax değeri 0,6 EÜ/mL.dk iken koyun sütü LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 60°C; Km değeri 0,08 mM ve Vmax değeri 0,05 EÜ/mL.dk olarak, manda sütü LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 70°C; Km değeri 0,08 mM ve Vmax değeri 0,46 EÜ/mL.dk olarak, keçi LPO için optimum pH 5,5; optimum sıcaklık 70°C; Km değeri 1,42 mM ve Vmax değeri 0,07 EÜ/mL.dk olarak tespit edildi. 5-amino-2-metil benzensülfonamid kolunu için LPO'nun bağlanma kapasitesi 15°C'de, pH: 9,0'da, 0,3 M'lık iyonik şiddet konsantrasyonunda optimum bağlanma 0,05 mg/g jel olarak tespit edildi.

To investigate the usability for the purification of the Lactoperoxidase (LPO E.C.1.11.1.7) enzyme from different mammalian milk, 5-amino-2-methylbenzenesulfonamide, 3,5-dichlorosülfanilamide, 2-amino-5-methyl-1,3-benzenedisulfonamide, sulfisomidin, sulfadiazine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfisoxazole, sulfacetamide, sulfamethoxypyridazine, sulfaguanidine molecules, which are sulfanilamide derivatives, were studied. For this purpose, the kinetic parameters of the molecules is determined using a pre-purified bovine LPO enzyme. Half maximal inhibitory concentration IC50 values were calculated for each molecules respectively 0.693, 115.00, 346.50, 173.00, 92.24, 309.00, 346.50, 221.70, 3.4, 173.20 and 17.15 and on the other hand Ki values were determined respectively 0.0004, 16.37, 103.32, 122.00, 90.66, 78.00, 198.00, 182.66, 870.00, 56.30 and 1.24 µM. Affinity columns were synthesized for each molecules which showed alternately inhibition and purification tables were prepared for each mammalian LPO enzyme. As a result of the purification step, 5-amino-2-methylbenzenesulfonamide is the highest potential among used molecules. Bovine LPO enzyme was purified 1059.37-fold with 82.68% yield, buffalo LPO was purified 509.09 -fold with 34.67% yield, sheep LPO was purified 232.55-fold with 14.35% and goat LPO was purified 161.90-fold with a yield of 11.30%. The purity of the purified enzyme was checked by SDS-PAGE and only one band approximately 80 kDa was found. Kinetic parameter of bovine LPO that purified from 5-amino-2-methylbenzenesulfonamide column, was performed for this purpose optimum pH: 6.0, optimum temperature 45°C, Km value 0.15 mM and Vmax value 0.6 EU/mL while for buffalo LPO optimum pH: 5.5, optimum temperature 70°C, Km value 0.08 mM and Vmax value 0.46 EU/mL were determined, for sheep LPO optimum pH: 5.5, optimum temperature 60°C, Km value 0.08 mM and Vmax value 0.05 EU/mL were determined, for goat LPO optimum pH: 5.5, optimum temperature 70°C, Km value 1.42 mM and Vmax value 0.07 EU/mL were determined. Binding capacity was determined 0.05 mg/g gel at 15°C pH: 8.0 and at a concentration of 0.3 M ionic strength.