Afinite kromatografisi tekniği ile tatlı turp (Raphanus sativus), Japon turpʼu (R. sativus L. var. longipinnatus) ve karnabahardan (Brassica oleracea) peroksidaz (POD) enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada; Tatlı Turp (Raphanus Sativus), Japon Turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) ve Karnabahar (Brassica oleracea) bitkilerinden peroksidaz (POD) enzimi Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzohidrazit afinite kromatografisi kullanılarak tek basamakta sırasıyla %19,65 verimle 25,75 kat, %9,6 verimle 34,74 kat ve %9,75 verimle 21,23 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak 470 nm'de ölçüldü. Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlelerini belirlemek için SDS-poliakrilamid jelelektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Molekül kütleleri tatlı turp (Raphanus Sativus) POD için yaklaşık 62,25 kDa, japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) POD için yaklaşık 62,21 kDa ve karnabahar (Brassica oleracea) POD için yaklaşık 57,3 kDa olarak bulundu. Enzimler üzerinde yapılan kinetik çalışmalar neticesinde optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH sırasıyla tatlı turp (Raphanus Sativus) için 6,5, 1,0 M, 35°C, 6,5, japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) için 6,5, 0,1 M, 35°C, 5,5 ve karnabahar (Brassica oleracea) için 6,00,1 M, 30°C, 5,5 olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için saf enzimlerin Km ve Vmax değerleri hesaplandı ve tatlı turp (Raphanus Sativus) için Km 0,41 mM, Vmax 1,43 EÜ/mL, japon turp (R.sativus L. var. longipinnatus) için Km 0,56 mM, Vmax 1,50 EÜ/mL ve karnabahar (Brassica oleracea) için Km 0,64 mM, Vmax 1,95 EÜ/mL olarak belirlendi. Ayrıca saf peroksidaz enzimleri üzerine 4-aminobenzohidrazit inhibitörünün inhibisyon etkisi in vitro şartlarda ayrı ayrı incelendi. 4-aminobenzohidrazit inhibitörü her üç bitki peroksidazı içinde yarışmalı inhibisyon göstermekte olup, tatlı turp (Raphanus Sativus) ve japon turpu (R.sativus L. var. longipinnatus) ve karnabahar (Brassica oleracea) için sırasıyla IC50 değeri 0,165, 0,283 ve 0,163 mM olarak, Ki değerleri ise sırasıyla 0,1406±0,037, 0,1288±0,028 ve 0,4233±0,022 mM olarak tespit edildi.

In this study, Peroxidase (POD) enzymes of sweet radish (Raphanus Sativus), japanese radish (R.sativus L. var. longipinnatus) and cauliflower (Brassica oleracea) plants were purified in a single step by using Sepharose-4B-Ltyrosine- 4-aminobenzohydrazide affinity chromatography as 19.65% yield, 25.75-fold, 9.6% yield, 34.74-fold and 9,75% yield, 21.23-fold, respectively. Enzyme activity was calculated spectrophotometrically procedure at 470 nm. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was done to check the molecular weights of enzymes and purity to determine and the recognized of single band. Molecular masses of enzymes for POD on sweet radish (Raphanus Sativus), japanese radish (R.sativus L. var. longipinnatus) and cauliflower (Brassica oleracea) were found to be approximately 62.25 kDa, 62.21kDa and 57.3 kDa, respectively. As a result of the kinetic tests on the POD enzymes; optimum pH, optimum ionic strength, the optimum temperature and stable pH were recorded as 6.5, 1 M, 35°C, 6.5 for sweet radish (Raphanus Sativus), 6.5, 0,1 M, 35°C, 5.5 for japanese radish (R.sativus L. var. longipinnatus) and 6, 0,1 M, 30°C, 5.5 for cauliflower (Brassica oleracea). Km and Vmax values were measured for the pure enzyme with using guaiacol as substrate and for sweet radish (Raphanus Sativus) Km and Vmax values were obtained to be as 0.41 mM and 1.43 EU/mL, japanese radish (R.sativus L. var. longipinnatus) 0.56 mM and 1.45 EU/mL and for cauliflower (Brassica oleracea) they were determined to be as 0,64 mM and 1,95 EU/mL. 4-aminobenzohydrazide has shown competitive inhibition on peroxidase enzymes of sweet radish (Raphanus Sativus), japanese radish (R.sativus L. var. longipinnatus) and cauliflower (Brassica oleracea), IC50 values were measured as 0.165 mM, 0.283 mM and 0.163 mM, Ki values were determined as 0.1406±0.037 mM, 0.1288±0.028 and 0.4233±0.022 mM, respectively.