Van ilinden alınan sıcak su örneklerinden termofilik bakterilerin izolasyonu, identifikasyonu, Bacillus licheniformis EA10`dan proteaz enziminin üçlü faz ayırma sistemi (TPP) ile saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu tez çalışması kapsamında; Van Çaybağı ve Hasanabdal Kaplıcalarından temin edilen sıcak su örneklerinden toplam 10 adet termofilik bakteri izole edildi. İzolasyon sonrasında yapılan konvensiyonel ve moleküler analizler sonucunda 10 izolat (EA1, EA2, EA4, EA5, EA6, EA7: Bacillus thermolactis; EA3, EA9, EA10: Bacillus licheniformis; EA8: Anoxybacillus pushchioensis) tür düzeyinde tanılandı. Petri denemeleri sonucunda 3 suşun proteaz enzim aktivitesi bakımından pozitif olduğu gözlemlendi, en yüksek aktiviteyi ise EA10 izolatının verdiği tespit edildi. B. licheniformis EA10'dan proteaz enziminin saflaştırılması TPP yöntemiyle ilk kez bu çalışmada uygulandı. Bunun için tuz, organik çözgen ve pH optimizasyonu yapıldı ve pH 6,0'da, 1,0:0,5 (ham enzim çözeltisi:t-bütanol oranı) ve %70 doygun amonyum sülfat kullanılarak uygulanan TPP sistemi sonucunda %191,6 verimle 54,1 kat saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE jel elektroforez yöntemiyle yaklaşık 37,67 kDa olarak hesaplandı. Protez enzimi için optimum pH 9,5 ve optimum sıcaklık 80°C olarak belirlendi. Enzimin 90°C gibi yüksek bir sıcaklıkta 120 dk inkübasyonun sonunda aktivitesinin hiç düşmediği ve inkübasyon süresinin aktiviteyi arttırıcı etki gösterdiği tespit edildi. B. licheniformis EA10'dan proteaz enziminin okside edici ajan olan H2O2 varlığında kararlılığını %1 ve %5'lik konsatrasyonlarda sırasıyla %107 ve %102 oranında koruduğu tespit edildi. Organik çözücülere karşı yüksek bir stabilite gösteren enzimin Mn2+ metalinin 1mM konsantrasyonunda aktivitesini koruduğu görüldü, 5 ve 10 mM'lık konsantrasyonlarında ise sırasıyla %164 ve %237 oranında enzimin aktivitesini artırdığı belirlendi. EDTA varlığında enzim stabilitesinin %104,6 oranında korunduğu belirlendi. B.licheniformis EA10'dan alkali proteaz enziminin hem kazeine hem de gelatine yüksek substrat spesifitesi olduğu görüldü, kazein substratı için KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,376 mg/ml ve 14,085 µmol.ml-1.dk-1 olarak hesaplandı.

In this thesis work, a total of 10 thermophilic bacteria were isolated from hot water samples collected from Van Çaybağı and Hasanabdal springs. 10 isolates were identified as follows using conventional and molecular analysis; EA1, EA2, EA4, EA5, EA6, EA7: Bacillus thermolactis; EA3, EA9, EA10: Bacillus licheniformis; EA8: Anoxybacillus pushchioensis. According to a pedri analysis, three strains were observed to be positive in terms of protease activity and EA10 had the highest activity. Purification of protease from B. licheniformis EA10 using TPP was carried out for the first time in this study to the best of our knowledge. For this, optimization of salt content, organic solvent and pH was done. The TPP system applied at pH 6.0 using 1.0: 0.5 (crude enzyme solution: t-butanol ratio) and 70% saturated ammonium sulphate resulted in 54.1 fold of enzyme purification with 191.6% yield and the molecular weight of the purified enzyme was estimated to be approximately 37.67 kDa by SDS-PAGE gel electrophoresis. The optimum pH and temperature were determined as 9.5 and 80 °C, respectively. It was found that the enzyme did not decrease its activity at all after 120 minutes of incubation at a temperature as high as 90 °C and that the incubation period had an activity-enhancing effect. It was also found that B. licheniformis EA10 protected its protease enzyme stability by 107% and 102% in the presence of H2O2, an oxidizing agent, at concentration ratios of 1% and 5%, respectively. The enzyme exhibiting high stability against organic solvents maintained its activity at 1 mM Mn2+ and increased its activity by 164 and 237% at 5 and 10 mM concentrations, respectively. In the presence of EDTA, enzyme stability was preserved by 104.6%. Results showed that alkaline protease of B. licheniformis EA10 had high substrate specificity for both casein and gelatin and the KM and Vmax values for casein substrate was calculated (KM; 0,376 mg/ml and Vmax; 14,085 µmol.ml-1.dk-1 ).