Glukoz oksidaz ve glukonik asit üretimi arttırılmış Aspergillus niger NRRL-3 mutantlarının eldesi

Abstract

11 ÖZET Bu çalışmada kullanılan Aspergillus nigerNRRL-3 susu glikoz oksidaz ve D-glukonik asit üreten endüstriyel bir organizmadır. Hücre-içi yerle şime sahip glukoz oksidaz (E.C. 1.1.3.4) enziminin aktivite tayininde, bir elektron akseptörü olan benzokinon kullanıldı. Buna göre, benzo- kinon'un redüksiyon ürünü olan hidrokinon ' un 290 nm'de gösterdiği ab- sorbans artışının başlangıçtaki hızı (AA/dakika) ölçüldü. Bir enzim ünitesi, 25` C de dakikada 1 Aimol benzokinon'un hidrokinon'a indirgenme sini katalizleyen enzim miktarı olarak tanımlandı. Üretim koşullarını optimize edebilmek amacıyla, durgun ve çalkantılı üretim şekilleri, üretim pH'sı ve sıcaklığı, enzim indüks iyonunu ger çekleştiren minumum glukoz miktarı ve kültür ortamının oksijence zenginleştirilmesi gibi fizyolojik parametreler incelendi. A. nigeA. WRRL-3 glukoz oksidazmın maksimum üretimi için, optimum pH: 5.6, optimum sıcaklık 30 `C olarak saptandı. Glukoz oksidaz enziminin indüksiyonu için minimum glukoz derişimi 0.002 M olarak belirlendi. Aynı zamanda çalkalama hızına ve ortamın oksijence zenginleştirilmesi ne bağlı olarak enzim aktivitesinin arttırılabileceği belirlendi. Glukoz oksidaz aktivitesinin arttırılabilmesi ve daha ekonomik koşul larda enzim üretiminin gerçekleştirilebilmesi için, A.nigeA. WRRL-3 susu nitröz asit ve U.V.+ N-metil-N'-nitrosoguanidin metodu kullanıla rak mutasyona uğratıldı, tndikatör olarak metil red içeren vasatlarda glukonik asit üretim yeteneği yüksek bulunan mutantlar, oluşturdukları zon çaplarına bağlı olarak seçildi. Elde edilen 11 mutant suş, 0.01, 0.1 ve 0.5 M D-glukoz içeren Czapek-Dox sıvı besi yerinde üretilerek aktiviteleri saptandı. Atasal susa göre aktiviteleri % 38.8 ve % 105.5 oranında artmış iki suş izole edilerek A&peAgilhi nigeA NSG-,, ve kt>pOAgUlUA nigeA NSG*. olarak adlandırıldı.

Ill SUMMARY k&poJxjgWLuA nigzx MRRL-3 which was used in this study is an industrial organism that produces glucose oxidase and D-gluconic acid. Benzoquinone which is an electron acceptor was employed for the intra-cellular glucose oxidase activity determination. For this purpose, the initial rate of increase (AA/min) in absorbans at 290 nm following the enzymatic reduc tion of benzoquinone to hydroquinone was muasured. One enzyme unite was defined as the amount of enzyme which catalyzes the reduction of 1 umol benzoquinone to hydroquinone in one minute at 25 *C Various pysiological parameters such as static and stirred production, growth temperature and pH, the minumum glucose concentration for the enzyme induction and enrichment of the medium with oxygen, was inves tigated for the optimization of cultural conditions. Optimum pH and temperature for the maximum production of k.nigOA blKR.L-3 glucose oxidase activity were obtained as 5.6 and 30 'C respectively. The minimum glucose concentration for the enzyme induction was found to be 0.002 M. At the same time, it was found that the enzyme activity could be elevated depending on the agitation rate and enrichment of the medium with oxygen. In the present study, k.nig&i WRRL-3 was treated with different mutagens such as nitrous acid and U.V.+ N-methyl-N'-nitrosoguanidine for the selection of mutants having the improved glucose oxidase production ability. These improved mutants were selected depending on the zone diameters on the growth medium containing methyl red as an chromogenic indicator. Eleven mutants that were selected with this procedure were cultured on the Czapex-Dox medium containing, 0.01, 0.1 and 0.5 M of glucose and screened for the glucose oxidase activity. Two of these mutants named k&pzitgiltuA nlgOA HSG~_* and A6peAgilla6 nigeA WSGj* were found to have increased glucose oxidase activity at the ratio of 38.8 % and 105.5 % respectively comparing the parental strain of A. nigeJL NRRL-3.