Box-Wilson istatiksel yöntemiyle mikrobiyal rennin üretiminin optimizasyonu

Abstract

ÖZET Bu araştırmada, ATCC'nin NRRL 3420 nolu Mucor miehie, mezofîlik küf mantar türü ile çalışılmış ve sanayi'de peynir mayası olarak bilinen rennin enziminin üretilebilmesi için mikroorganizmanın büyüme ve enzim üretim koşullan incelenerek; optimum koşullar tespit edilmiş ve elde edilen asit proteazm maksimum süt pıhtılaştırma aktivitesi verebilmesi için en uygun fermentasyon parametreleri saptanmıştır. Mucor Miehie' nin optimum büyüme koşullarının belirlenebilmesi ve maksimum süt pıhtılaştırma aktivitesini veren enzim derişiminin elde edilebilmesi için Box-Wilson deneysel tasarımına göre 77 deney saptanmış ve bu - deneylerde birbirinden bağımsız altı büyüme faktörünün (başlangıç; D-glikoz ve amonyum iyonu derişimleri, aşılama oranı, başlangıç pH'ı, çalkalama hızı ve ortam sıcaklığı) elde edilen enzimin süt pıhtılaştırma aktivitesine olan etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmada çarpıcı olan önemli noktalardan biri besi ortamının fomülü ve miktarı belirli kimyasallardan hazırlanmasıdır. Doğal besin kaynaklarını içermeyen bu büyüme ortamı, gerek analizlere getirdiği kolaylık, gerekse mikroorganizmanın besin tüketimindeki davranışını net bir şekilde izleyebilmek açısından önemli avantajlar sağlamıştır. Maksimum süt pıhtılaştırma aktivitesini veren enzim derişimi için optimum koşulların tespit edilebilmesi amacıyla, model deneylerinin tümü 250 ml'lik erlenlerde tamamen steril koşullarda, çalkalayıcı su banyosunda kesikli olarak yürütülmüştür. Ayrıca yine tamamen steril koşullarda olmak üzere kesikli sistem fermentörlerde de deneyler yapılmıştır. Yürütülen deneylerde, her bir çalışma 7-10 gün arasında devam ettirilerek sonuç glikoz, amonyum iyonu derişimleri, pH, çözünmüş O2 değerleri ölçülmüş ve süt pıhtılaştırma aktiviteleri saptanmıştır. Çalışılan mikroorganizma için en iyi büyümenin ve maksimum süt pıhtılaştırma aktivitesi veren enzim derişiminin elde edildiği optimum koşullar; 37.6°C sıcaklık, 6.8 pH, 81 vuru/dk çalkalama hızı, 29.6 g/lglikoz, 1.25 g/l amonyum iyonu ve % 5.2 v/v aşılama oranı olarak bulunmuştur. Buna göre maksimum süt pıhtılaştırma aktivitesi olarak fermentasyon ortamından saflaştırma yapmaksızın 5.71 IU/ml değerine ulaşılmıştır. Oysa piyasada bulunan ve saflaştırma işleminin yapıldığı ticari bir şirden rennetinin süt pıhtılaştırma aktivitesi 28 IU/ml olarak tespit edilmiştir. Eğer mikrobiyal rennin enzimi için de saflaştırma yapılırsa ticari rennin aktivite değerinin çok üstüne çıkabilir. Sonuç olarak; önerilen yapay besi ortamıyla mikroorganizmanın uygun büyümesi sağlanarak elde edilen enzim derişi minin yüksek süt pıhtılaştırma aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. Elde edilen bu enzimin ham olarak sanayide kullanılan, şirdenden elde edilen saflaştırılmış ticari peynir mayası ile yarışabilir özelliğe sahip olduğu anlaşılmıştır. Ancak elde edilen bu sonuçların sanayide verimli bir şekilde uyarlanabilmesi için optimum noktaların sürekli sistem fermentörlerde sağlanması ve gerekli saflaştırma işlemlerinin yapılması daha uygun gözükmektedir. Böylece sürekli üretim sağlanarak rennin enziminin daha ekonomik olarak üretimi gerçekleştirilebilir.

Summary vi SUMMARY In this research, a mesophilic fungus, Mucor miehei NRRL 3420 from ATCC has been investigated to produce rennin-like enzyme for milk clotting. In the experiments, growth conditions of the microorganism were examined, optimum conditions were determined and the parameters yielding maximum milk clotting activity were obtained. In order to investigate the optimum growth conditions of Mucor miehei and to obtain the enzyme concentration that giving the maximum milk-clotting activity, 77 experimental runs were fixed according to the Box-Wilson experimental design, and the influence of six independent growth factors (Initial D-glucose and ammonium ion concentrations, inoculum ratio, pH; agitation rate and temperature) on the specific growth rate and the influence of the product rennin on the milk-clotting activity have been investigated. The most interesting part of this research is that the formula and quantity of the growth media was prepared synthetically from certain chemicals. Since the analysis of chemicals were simplified and the nutrient assimilation could be monitored easily, synthetic growth media did not contain natural nutrients. In order to determine the enzyme concentration yielding the maximum milk-clotting activity all of the model experiments were carried out as batch under sterile conditions in erlenmayers of 250 ml at water shaker bath. Additionally, batch system fermentor experiments were carried out under sterile conditions. During the experiments, each run lasted 7-10 days and final D-glucose and ammonium ion concentrations, pH, dissolved O2 values were measured along with milk-clotting activity. The operational conditions satisfying the best growth of microorganism 'and the enzyme concentration yielding maximum milk-clotting activity were determined as: temperature 37.6°C, pH 6.8, agitation rate 81 spm, initial D-glucose 29.6 g/I, initial ammonium ion concentration 1.25 g/1 and inoculum ratio 5.2 % v/v.Summary vii The maximum milk-clotting activity has been found as 5.71 IU/ml of fermentation broth prior to purification. Meanwhile, milk-clotting activity for an industrial enzyme has been found as 28 IU/ml. If microbial rennin is enriched, its milk-clotting activity will be much higher than that of industrial rennin enzyme. As a result, synthetic media was found to be sufficient and adequate for the growth of the microorganism and enzyme concentration obtained has been shown to posses high milk clotting activity. This proves that microbial rennin is competible with industrial enzyme on activity basis. However for full substitution of animal rennet, other aspects of cheese production such as taste, flavor etc. as well as continuous production of microbial rennin preceding purification have to be taken into consideration.