K-Kazeinin serbest ve tutuklu kimozin ile hidrolizinin kinetiği

Abstract

IV ÖZET Bu çalışmanın amacı kimozin/K-kazein tepkimesini kinetik açıdan serbest ve tutuklu enzim sistemlerinde incelemektir. Bu amaç doğrultusunda serbest kimozin/K-kazein tepkimesi kinetiği değişik sıcaklıklarda (7 °C, 22 °C ve 37 °C) ve doğal ve yapay tepkime ortamlarında (süt çözelti1` `e K-kazein çözeltisi) çalışılmıştır. Kimozini kalsiyum aljinat ortamında tutuklamak için standart jel hazırlama yöntemi geliştirilmiş ve çalışma amacına en uygun olan jel tutuklu kimozin deneylerinde kullanılmıştır. Tutuklu kimozin/K-kazein tepkime kinetiği, serbest kimozin sistemi için verilen deney koşullarında çalışılmıştır. Her iki sistem için de gerçek tepkime kinetiği sabitleri zamana bağımlı Michaelis-Menten Yöntemi (MMY) ile saptanmıştır. Serbest ve tutuklu kimozin tepkime sabitlerine sıcaklığın ve tepkime ortamının etkisi, iki tepkime sisteminin kinetik sabitleri arasındaki farklar, doğal ve yapay çözeltilerde K-kazein moleküllerinin farklı yapılarda bulunmasıyla açıklanmıştır. Deney koşullarında serbest kimozin/K-kazein tepkimesi dönüşüm-zaman ilişkisi 0.970- 0.993 arasında bir bağlanım katsayısıyla açıklanmıştır. Tepkime Michaelis-Menten sabiti (Km) süt çözeltisinde artan sıcaklıkla azalmış, K-kazein çözeltisinde ise sıcaklıktan etkilenmemiştir. Km değeri 37 °C, 22 °C ve 7 °C da süt çözeltisinde sırasıyla 0.073 umol/ml, 0.105 umol/ml ve 0.160 umol/ml, K-kazein çözeltisinde sırasıyla 0.026 umol/ml, 0.028umol/ml ve 0.029 umol/ml bulunmuştur. Tepkime hız sabiti (k3) süt ve K-kazein çözeltisinde artan sıcaklıkla artmıştır. k3 değeri 37 °C, 22 °C ve 7 °C da süt çözeltisinde sırasıyla 64.9 l/san, 32.2 l/san ve 16.0 l/san, K-kazein çözeltisinde sırasıyla 177.3 l/san, 82.7 l/san ve 48.9 l/san bulunmuştur. Kaynaklardan elde edilen serbest kimozin/K-kazein tepkimesi kinetik sabitleri ile bu çalışma kapsamında saptanan kinetik sabitleri arasında büyüklük açısından bir uyum gözlenmemekle beraber, sıcaklık ve tepkime ortamının sabitlere etkisi açısından genel bir uyum gözlenmiştir. Standart olarak hazırlanan dokuz değişik kalsiyum aljinat jeli arasından % 3 sodyum aljinat- 100 mM CaCİ2 bileşiminden oluşan jel, yapısında görece fazla enzim tutması, yapı içinde substrat hareketine izin vermesi, görece mekanik açıdan kararlı olması ve hazırlamasının kolay olması nedeniyle tutuklu kimozin çalışmalarında kullanılmıştır. Deney koşullarında tutuklu kimozin/K-kazein tepkimesi dönüşüm-zaman ilişkisi 0.942- 0.983 arasında bir bağlanım katsayısıyla açıklanmıştır. Tepkime gerçek Michelis- Menten sabiti (KM,ger) süt çözeltisinde artan sıcaklıkla artmış, K-kazein ortamında sıcaklıktan etkilenmemiştir. KM,ger değeri 37 °C, 22 °C ve 7 °C da süt çözeltisinde sırasıyla 0.133 umol/ml, 0.154 umol/ml ve 0.263 umol/ml, K-kazein çözeltisindesırasıyla 0.029 umol/ml, 0.034 u,mol/ml ve 0.030 (imol/ml bulunmuştur. Tepkime gerçek hız sabiti (k3)ger) süt ve K-kazein çözeltisinde artan sıcaklıkla artmıştır. k3>ger değeri 37 °C, 22 °C ve 7 °C da süt çözeltisinde sırasıyla 46.5 l/san, 21.6 l/san ve 14.7 l/san, K-kazein çözeltisinde sırasıyla 146.4 l/san, 75.2 l/san ve 43.7 l/san bulunmuştur. Her iki enzim sisteminde süt ve K-kazein ortamında tepkime hız sabitinin sıcaklığa bağımlılığı Arrhenius bağmtısıyla 0.986-0.996 arasında bir bağlanım katsayısıyla açıklanmıştır. Tutuklama işleminin enzim tepkime aktivasyon enerjisini (Ea) belirgin bir şekilde etkilemediği gözlenmiştir. Serbest kimozin deneylerinde, süt ve K-kazein çözeltisinde Ea değerleri sırasıyla 7195*10-6 kal/umol ve 7376*10-6 kal/umol, tutuklu kimozin deneylerinde sırasıyla C510*10-6 kal/umol ve 6993*10-6 kal/umol bulunmuştur. Küresel kalsiyum aljinat ortamında eşzamanlı kimozin/K-kazein tepkimesi ve K-kazein difüzyon modeli, kesikli kap düzeneği için sayısal yöntemlerle çözümlenmiş ve sisteme özgü ortalama etkinlik faktörü (tj) ve Thiele Modülü (O) değerleri saptanmıştır. Çalışma koşullarında süt ve K-kazein çözeltileri için kalsiyum aljinat j elinde eşzamanlı olayın tepkime ve difüzyon kontrollü olduğu ve difüzyon kısıtlamasının süt ortamında K-kazein ortamına göre daha baskın olduğu saptanmıştır. r/ ve O değerlerinin sıcaklıktan etkilenmediği, tepkime ortamıyla değiştiği saptanmıştır, rj değeri süt ve k- kazein çözeltisinde sırasıyla 0.63 ve 0.76, <E> değeri sırasıyla 5.5 ve 4.5 bulunmuştur.

VI ABSTRACT The aim of this research is to investigate the kinetics of free and immobilized chymosin/K-casein reaction. The r:search was conducted at three different temperatures (7 °C, 22 °C and 37 °C) and in natural and synthetic reaction mediums (milk and K-casein solutions). A standard method was developed for the preparation of calcium alginate gel in attempt to immobilize chymosin and the most appropriate alginate bead was selected, taking the experimental conditions into account. The kinetics of immobilized chymosin/K-casein reaction was investigated at the same conditions as the free chymosin system. The kinetic constants for the both systems were determined by using Integrated Michaelis-Menten Method. The effects of temperature and the reaction medium on the kinetic constants were evaluated, on the basis of molecular structure of K-casein in natural and synthetic mediums. The conversion-time relationship of the free chymosin system was expressed by a correlation coefficient of 0.970-0.993 at the experimental conditions. The reaction Michaelis-Menten constant, Km, increased with increasing temperature in the milk solution and it was not affected by temperature in the K-casein solution. For the milk solution, the values of Km were detennined as 0.073 umol/ml, 0.105 umol/ml and 0.160 umol/ml at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. For the K-casein solution,they were determined to be 0.026 umol/ml, 0.028umol/ml and 0.029 umol/ml at 37 °C, 22 °C.and 7 °C, respectively. The reaction rate constant, k3, increased with increasing temperature in both reaction mediums. For the milk solution, k3 values were determined as 64.9 1/sec, 32.2 1/sec and 16.0 1/sec at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. For the K-casein solution, they were found to be 177.3 1/sec, 82.7 1/sec and 48.9 1/sec at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. A general agreement was observed from the points view of the effect of temperature and reaction medium on the reaction kinetic constants, but the results do not show close agreement with the literature in terms of the order of magnitude. Among the nine calcium alginate gels taken to experiment, the matrix of 3 % Na- alginate/100 mM CaC^ was selected for its relatively high capacity of enzyme entrapment, sufficiently large pore structure for the substrate diffusion, and relatively high mechanical stability. The reaction-time relation of the immobilized chymosin system was expressed by a correlation coefficient of 0.942-0.983 at the experimental conditions. The reaction intrinsic Michaelis-Menten constant, KM,int5 increased with increasing temperature in the milk solution and it was not affected by temperature in the k-casein solution.. Forvu the milk solution, the values of KM,int were determined as 0.133 (imol/ml, 0.154 u mol/ml and 0.263 umol/ml at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. For the K-casein solution, they were determined to be 0.029 umol/ml, 0.034 umol/ml and 0.030 jj, mol/ml at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. The reaction intrinsic rate constant, k3,int, increased with increasing temperature in both reaction mediums. For the milk solution, the values of k3sint were determined as 46.5 1/sec, 21.6 1/sec and 14.7 1/sec at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. For the K-casein solution, they were determined to be 146.4 1/sec, 75.2 1/sec and 43.7 1/sec at 37 °C, 22 °C and 7 °C, respectively. The relation between k3 and temperature was expressed by an Arrhenius type equation with a correlation coefficient of 0.986-0996 for both milk and K-casein solutions. The immobilization process did not significantly affect the activation energy, Ea. For the free chymosin experiments with milk and K-casein solutions, the values of Ea were determined as 7195*10-6 cal/umol and 7376*10-6 cal/u,mol, respectively. For the immobilized chymosin experiments with milk and K-casein solutions, the values of Ea were determined to be 6610*10-6 cal/umol and 6993*10-6 cal/ujmol, respectively. The simultaneous chymosin/K-casein reaction and K-casein diffusion model derived for spherical coordinates was solved numerically for batch-type reactor system and the average values of effectiveness factor, rj, and Thiele module, O, were calculated for the system. The phenomena was diffusion controlled and the effect of diffusion resistance was more significant in the milk solution. The effectiveness factor and Thiele module were not temperature dependent and changed with the reaction medium. The values of tj were determined as 0.63 and 0.76 for the milk and K-casein solutions respectively. The values of -î>, on the other hand, were determined as 5.5 and 4.5 for the milk and K-casein solutions.