Kitinaz`ın aspergillus niger ve penicillium`dan eldesi ve bazı fitopatojenlere karşı antifungal etkisinin araştırılması

Abstract

Özet ÖZET Sunulan araştırmanın amacı fungal kaynaklardan kirinaz enzimini elde etmek, bu enzimin antifungal aktivitesini araştırmak ve fungusitler ile birlikte kullanıldığında bitki patojenleri üzerinde sinerjik etkisinin olup olmadığını göstermektir. Kirinaz üretimi için Aspergillus niger ve Penicillium spimılosum kullanıldı Funguslar öncelikle Potato Dextrose Ağarda (PDA) üretildi ve kirinaz üretimi, Enzyme Production Medium (EPM)'da gerçekleştirildi. Bu ortamda her iki fungus için enzim ürerim koşullan optimize edildi. A.niger için bu koşullar 48 saat, 30 °C, pH 6, 104 komdi/40ml, %0.5 g kolloidal kitin ve çalkalaman ortam, P. spimılosum 'da farklı olarak 106 konidi/40 mi bulundu. EPM ortammda üretilen kirinaz enzimi amonyum sülfatlama ve dializ ile kısmı olarak saflaştınldı ve A.niger krtinazı (Kit A) 17,35 kat, P.spimılosum krtinazı (Kit P) 10,73 kat saflaştınldı. Bundan sonra tepkime ortamında enzimin spesifik aktivitesini etkileyen optimum fizyolojik koşullar araştırıldı. Bunlar A.niger için 60 dakika, 30 °C, pH 5.5 ve Km 1.8 mg kitin/mi, P.spinulosum için 30 dakika, 30 °C, pH 5.5 ve Km 2.7 mg kitin/ml olarak saptandı. Sinerjik etki için denenen fungusitler çaptan, benomyl ve maneb, fitopatojen funguslar ise Rhizoctonia oryzae, Fusarium culmorum ve Bipolaris sorokiniana'Ğır. Fungusitler, fitopatojen funguslann üretildiği PDA ortamlarına 0.1, 1, 10, 100, 1000 ppm olacak şekilde, enzimler ise 0.64, 3.2, 6.4, 9.6 ve 12.8 U/ml olacak şekilde steril olarak ilave edildi. Bu ortamda fitopatojen funguslann inhibisyon yüzde oranlan ve ayrıca doz cevap eğrisi kullanılarak fungusit ve enzimlerin ED50 değerleri saptandı. Fungusitlerin düşük konsantrasyonlarından (0. 1 ve 1 ppm) en az etkilenen Roryzae iken Kit A ve Kit P'den de en az etkilenen yine aynı fungusdur. Kit A ve Kit P'nin fitopatojenlerin koloni gelişimini % 60'a kadar inhibe ettiği bulundu. Bununla beraber Kit A'nın Kit P'den daha etkili olduğu ve sonuç olarak bu enzimlerin antifungal aktivitesinin bulunduğu saptandı. Fungusitler ve kitinaz enzimleriÖzet birlikte kullanıldıklarında tek tek bulunduklarından daha fazla etkili oldukları saptandı. Örneğin maneb 100 ppm'de F. culmonım'vm. koloni gelişimini %51 inhibe ederken, Kit A ve Kit P ile birlikte kullanıldığında misel gelişiminin % 100 inhibe olduğu saptandı. Bununla beraber Kit A-fungusit kombinasyonlarında sinerjik etkinin daha yüksek olduğu gözlendi. Çalışmamızın sonuçlarına göre Kit A ve Kit P'nin fungusitler ile birlikte kullanılmasınm antifungal etki üzerine sinerjik etki gösterdiği söylenebilir.

Abstract iii ABSTRACT The aim of this research is to produce chitinase enzyme from fungal sources and to research the antifungal activity of this enzyme also to determine any probable synergic effect of the enzyme combined with fungicides. For chitinase production, A.niger and P.spinulosum were used. At first, fungi were grown on Potato Dextrose Agar (PDA) and the chitinase production was realized on Enzyme Production Medium (EPM). Using this medium, for both fungi the production of enzyme conditions were optimized. It was shown that when the pH of the medium, which contained 0.5 % g colloidal chitin, was adjusted to pH 6.0, and the cultivation was carried out at 30 °C for 48 hours, with aeration the chitinase production increased for both fungi. It was also detected that for A.niger inoculation with 104 conidia/ 40 ml, and 106 conidia/40 ml for P.spinulosum gave maximal enzyme production. Kit A 17.35, and Kit P 10.73 fold partially purified using ammonium sulfate precipitation and dialysis. As a second step of the research, the conditions effecting the specific activity of chitinase in reaction medium were also determined. These conditions were as follows: For A.niger chitinase, 60 min, 30 °C, pH 5.5, Km 1.8 mg chitin/ml and for P.spinulosum chitinase 30 min, 30 °C, pH 5.5 and Km 2.7 mg chitin/ml. The synergic affect of the enzyme whit fungicides, çaptan, benomyl and maneb were determined. Also phytopathogenic fungi Rhizoctonia oryzae, Fusarium culmorum and Bipolaris sorokiniana were used. Fungicides were added to PDA medium in which phytopathogen fungi were inoculated at 0.1, 1, 10, 100, 1000 ppm and sterilized enzymes at 0.64, 3.2, 6.4, 9.6 and 12.8 U/ml concentrations and the ED50 values of the fungicides and enzymes were determined. For the determinations of ED50 values the dosage response curve was used. R. oryzae was shown as the least affected fungus from low concentrations of fungicides and from Kit A and Kit P. It was determinedAbstract iv that the coloni growth was inhibited up to 60 % with Kit A and Kit P for all phytopathogens. In addition, Kit A was much more effective than Kit P and as a result it was found that these enzymes have antifungal activity. It is also been detected that enzymes were much more effective when used together with fungicides. For example, the 100 ppm concentration of maneb inhibited the coloni growth of F.culmorum 51 %, but this inhibition was increased to 100 % when it was combined either with Kit A or Kit P. However it is observed that the synergic effect of enzyme - fungicide combinations, is higher when Kit A is used as enzyme preparation. According to these results it can be said for maneb, çaptan and benomyl that Kit A and Kit P have an increasive effect on their fungicidal activity.