HPLC kolonlarında DNA saflaştırılması için spesifik sorbent üretimi

Abstract

HPLC KOLONLARINDA DNA SAFLAŞTIRILMASI İÇİN SPESİFİK SORBENT ÜRETİMİ NAGİHAN ÇAĞIRICI ASMA ÖZ Yapılan tez çalışmasında bütün canlılarda hayatsal olayların şifresini taşıyan molekül olan DNA'nın saflaştırılması için polimerik sorbent geliştirilmesi, geliştirilen bu sorbentlerin kesikli sistemde ve HPLC sisteminde kullanılabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Spesifik sorbent olarak monodispers yapıda poli( S-DVB-GMA) partikülleri hazırlanmıştır. Bu partiküller, çok basamaklı mikrosüspansiyon polimerizasyonu yöntemiyle yaklaşık 12 um boyutuna sahip olacak şekilde makrogözenekli formda sentezlenmiştir. Hazırlanan partiküllerin DNA moleküllerine afinite gösterebilmesi için partikül üzerinde bulunan epoksipropil grupları primer amin formuna dönüştürülmüştür. Hazırlanan amin bağlı partiküllerin DNA adsorpsiyon ve desorpsiyonu ilk önce kesikli sistemde incelenmiştir. Daha sonra kesikli sistemde elde edilen sonuçlardan da yararlanılarak DNA molekülünün adsorpsiyon ve desorpsiyonu HPLC sisteminde gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen partiküller 4,6x50 mm boyutlarına sahip standart HPLC kolonlarına doldurulmuştur. HPLC sistemi, izokratik koşullarda çalıştırılarak DNA adsorpsiyon ve desorpsiyon deneyleri yapılmıştır. Yapılan deneylerin sonuçlarına göre, DNA molekülünün maksimum adsorpsiyonu pH 4,0 tamponu kullanıldığında gerçekleşmektedir. Kesikli sistemde maksimum adsorpsiyon 19,79 mg/g dır. Maksimum desorpsiyon oranı ise % 56,3 dür. HPLC sistemi kullanıldığında deneyler 0,5 mg/ml ve 1.0 mg/ml başlangıç DNA derişimi için yapılmış ve her iki başlangıç DNA derişimi için de adsorpsiyon kapasitesinin akış hızının artmasıyla düştüğü gözlenmiştir. 0,5 mg/ml başlangıç DNA derişiminde gerçekleştirilen adsorpsiyon sonrası kolonda yapılan desorpsiyon deneylerinden desorpsiyon oranının her akış hızında yaklaşık % 100 olduğu görülmüştür. 1 mg/ml başlangıç DNA derişimindeadsorpsiyon deneyleri yapılıp DNA adsorplamış partiküllerin bulunduğu kolona desorpsiyon ajanı gönderildiğinde ise akış hızının artmasıyla desorpsiyon oranının düştüğü tespit edilmiştir. Kolon DNA adsorpsiyon ve desorpsiyonu için uygundur. Sonuç olarak, hazırlanan polimerik sorbentlerin, DNA saflaştırılması için HPLC kolon dolgu materyali olarak kullanılabileceği tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler : DNA, DNA saflaştırma, poli (S-DVB-GMA),HPLC Danışman: Prof. Dr. Erhan Pişkin, Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı Eş Danışman : Prof. Dr. Süleyman Ali Tuncel, Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı II

PRODUCTION OF SPECIFIC SORBENT FOR DNA PURIFICATION AT HPLC COLUMN NAGİHAN ÇA?IRICI ASMA ABSTRACT In this thesis, the main purpose is to develop a new polymeric sorbent for the purification of DNA molecule which carries genetic-codes for life and search for their use in batch and HPLC systems. Monodisperse poli (S-DVB-GMA) particles were prepared as spesific sorbent. These particles were synthesized by multistep microsuspension polymerization method as macroporous and 12 urn in diameter. Epoksipropyl groups on the surface of the particles were transformed to primer amines to have an affinity to DNA molecules. First of all, adsorption and desorption of these particles to DNA were, examined in batch system. Then, obtained data from batch system were used for the examination of DNA adsorption and desorption in the HPLC system. Synthesized particles were filled in to 4,6x50 mm standart HPLC column. DNA adsorption and desorption experiments were conducted in HPLC system working at isochratic conditions. From the experiments, maximum adsorption of DNA molecule were obtained when pH 4.0 buffer used. In the batch system maximum adsorption was 19,79 mg/g. Maximum desorption ratio was 56,3 %. 0,5 mg/ml and 1 mg/ml initial concentrations were used for the HPLC system and it was observed that adsorption capacity decreases with increasing flow rate for both initial concentrations. After adsorptions in the column for the 0,5 mg/ml initial concentration of DNA, desorption experiments showed that 100 % desorption ratio was observed for every flow rate. When the adsorption experiments completed with 1 mg/ml DNA concentration, desorption agent was sent to the column and it was determined, that desorption ratio decreases with increasing flow rate. IllColumn is very convenient for the adsorption and desorption of DNA. Finally, prepared polymeric sorbents can be used for the HPLC column as filling material for the DNA purification. Key Words : DNA, DNA purification, poll (S-DVB-GMA), HPLC Advisor : Prof. Dr. Erhan Pişkin, Hacettepe University Departmant of Chemical Engineering Co-advisor : Prof. Dr. Süleyman Ali Tuncel, Hacettepe University Departmant of Chemical Engineering IV