Anoxybacillus gonensis glukoz izomerazının genetik manipulasyonlarla bazı biyokimyasal özelliklerinin geliştirilmesi

Abstract

Glukoz izomeraz (D-ksiloz ketol izomeraz; EC 5.3.1.5), büyümek için karbon kaynağı olarak ksilozu kullanabilme yeteneğine sahip, birçok bakteride bulunan hücre içi bir enzimdir. Glukoz izomeraz, D-ksilozun D-ksiluloza dönüşümünü katalizlediği gibi D-glukozun D-fruktoza dönüşümünü de katalizlemektedir. Bu ikinci özelliği HFCS (fruktoz şurubu) üretiminde endüstriyel alanda kullanılmaktadır. Glukoz izomeraz bugün dünyada ticari amaçla en çok kullanılan üç enzimden biridir.Bu çalışmada, Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomeraz geni klonlanarak izole edildi ve baz dizilimi belirlendi. İzole edilen gen, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli BL21(DE3) suşu içerisinde yüksek miktarlarda üretildi. Bütün glukoz izomerazlar, amino asit dizilimleri açısından, oldukça korunumlu bazı bölgelere sahiptirler. Bu bölgeler incelenerek, bölge özgün mutasyon yöntemiyle, klonlanan glukoz izomeraz üzerinde W137F, V184T, V184S, H99Q, H99N, H99D, H99E ve H99L mutasyonları yapıldı. Yaban tip ve mutant enzimler kolon kromatografisi yöntemiyle saflaştırıldı ve karakterize edildi. Tüm mutant enzimler yaban tip enzim ile biyokimyasal özellikleri ve kinetik parametreleri bakımından karşılaştırıldı.Yaban tip enzimin optimum pH'sı 6,5, optimum sıcaklığı 85°C, Km'si 146,08 ± 9,50 mM ve Vmax'sı ise 43,72 ± 1,01 µmol/dk/mg protein olarak belirlendi. Yapılan W137F mutasyonu ile Km değeri 64,02 ± 2,10 mM'a düşürüldü. V184T, V184S mutasyonları enzim kinetik parametrelerinde önemli bir değişiklik meydana getirmezken genel olarak H99 ile yapılan mutasyonlar sonucu enzimin Km değerinde bir artış Vmax değerinde ise bir azalış gözlendi. Yapılan W137F/ V184S mutasyonu ile Km değeri 39,29 ± 2,87 mM'a düşürüldü.

Glucose isomerase (D-xylose ketol isomerase; EC 5.3.1.5) is an intracellular enzyme found in a number of bacteria that utilize xylose as carbon substrate for growth. Glucose isomerase converts D-xylose to D-xylulose in vivo and also catalyzes the conversion of D-glucose to D-fructose in vitro. The latter activity is used in industry for the production of high fructose corn syrup (HFCS). Therefore, glucose isomerase is one of the largest volume commercial enzymes used today.Gene coding for thermophilic glucose isomerase of Anoxybacilus gonensis G2T was isolated and its complete nucleotide sequence was determined. The gene has been cloned to plasmid vector pET-28a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). Several discrete regions were highly conserved throughout the amino acid sequences of all glucose isomerases. By examining this regions; W137F, V184T, V184S, H99Q, H99N, H99D, H99E, and H99L mutations were performed by site-directed mutagenesis techniques at cloned glucose isomerase. The wild type enzyme and mutant enzymes were purified by colon chromatography techniques. The biochemical properties of all glucose isomerases were characterized. All mutant enzymes compared with wild type enzyme for biochemical properties and kinetics parameters.The wild-type optimal temperature was 85°C and maximal activity was observed in a pH 6,5. Its Km and Vmax value was calculated as 146,08 ± 9,50mM and 43,72 ± 1,01 µmol/dk/mg protein respectively. W135 F mutation reduced Km value to 64,02 ± 2,10. V184T and V184S has not changed kinetic parameters. H99 mutations were generally increased Km value and reduced Vmax value. W135 F/ V184T mutation reduced Km value to 39,29 ± 2,87 mM.