Mezenkimal kök hücre saflaştırması için manyetik yüklü nanosorbentlerin üretimi

Abstract

Rejeneratif tıbbın gelişmesine paralel olarak kök hücre kullanılan tedavilere ilgi hızlaartmaktadır. Diğer kök hücrelerin sahip oldukları özelliklerin yanında, ek olarak trans-farklılaşma kapasiteleri nedeniyle mezenkimal kök hücreler diğerlerine göre çok dahafazla ilgi çekmektedir. Kemik iliği, kordon kanı, çevre kanı gibi hücre kaynaklarındamezenkimal hücre miktarı düşüktür, ancak bunlar uygun yöntemler ile izole edilebilir;sayılarının artırılması için hücre kültür ortamlarında in vitro kültürleri yapılabilir; kemik,kıkırdak, vb. gibi çeşitli dokuların onarımında kullanılmak üzere farklılaşmalarısağlanabilir. Kök hücre ayrılması ve hücre kültürü için çeşitli protokolleruygulanmaktadır, ki bunların birçoğunda manyetik yüklü spesifik sorbentler yeralmaktadır. Hem mikron hem de nanometre boyutlarında manyetik partiküller ticariolarak mevcuttur. Yapılan çalışmada hücre süspansiyonların mezenkimal kökhücreleri saflaştırmak amacıyla manyetik yüklü polimerik nanosorbentlerin üretimiamaçlanmıştır. Bu amaçla ilk önce manyetit Fe3 O4 partiküller 70-500nm aralığındaikili çöktürme yöntemi ile sentezlenmiştir. Sentezlenen manyetit nanopartiküllerkullanılarak daha sonra mikroemülsiyon polimerizasyonu ile MMA/AAc kaplınanopartiküller, yüzey aktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu ile PEG/MAkaplı nanopartiküller 150-500nm boy aralığında sentezlenmiştir. Sentezlenennanopartiküllerin hücre üzerindeki sitotoksik etkileri MTT testi ile belirlenmiştir.Sentezelenen nanopartiküllerin karakterizyonu Zeta Sizer, XRD, DSC ile yapılmışVSM ile manyetik özellikleri belirlenmiştir. Sentezlenen karboksilik asit (-COOH)fonksiyonel uç taşıyan MMA/AAc nanopartiküllere, optimizasyon çalışmalarısonucunda elde edilen veriler ışığında mezenkimal kök hücre özgün CD 105 ve CD73 antibadileri kovalent olarak bağlanarak mezenkimal kök hücreleri uygunkaynaklardan saflaştırılmasını sağlayacak nanosorbentler elde edilmiştir. Hemüretilen nanosorbentler hem de ticari örnek (MACS CD 105 Microbeads) ile hemakışlı manyetik ayırıcı sistemlerde hem de kesikli çöktürmeli manyetik ayırıcısistemlerde hücre süspansiyonundan saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Sonuçlarakışlı hücre ölçer ile analiz edilmiştir.Sonuç olarak tez kapsamında çeşitli kaynaklarda mezenkimal kök hücrelerinsaflaştırılmasını sağlayacak, ticari ile rekabet edebilecek, hem kesikli-çöktürmeli hemde akışlı manyetik ayırma sistemlerinde kullanılabilen manyetik yüklü PMMA/AAcbazlı nanosorbentler üretilmiştir.A n a h t a r K e l i m e l e r : Manyetik nanosorbentler, polimerizasyon, saflaştırma,mezenkimal kök hücre.Danışman: Prof.Dr. Erhan PİŞKİN, Hacettepe Üniversitesi, Kimya MühendisliğiBölümü.

As the use of regenerative medicine rapidly increases, mesenchymal stem cells areattracting much attention, more than other stem cells due to their rapid availabilityand transdifferentiation capacity. The number of mesenchymal cells are few in thecord blood, bone marrow and peripheral blood however, they may be isolatedaccordingly; cell-cultured in vitro to increase their number; and differentiated todifferent cells to apply in the repair/reconstruction of several tissues including boneand cartilage. There are several isolation and cell-culturing protocols in whichmainly magnetically loaded sorbents are used for specific separation of stem cells.There are commercially available magnetic beads are used today both in micronand nanometer size ranges. This study aims to develop alternative magneticallyloaded nanoparticles carrying specific ligands (CD105 ve CD73 antibadies) forseparation of mesenchymal stem cells from cell suspensions. In the first part,super-paramagnetic magnetite (Fe3O4) nanoparticles, between 70-500 nm in range,are produced by co-precipitation method. MMA/AAc coated nanoparticles weresynthesized by microemulsion polymerization, and PEG/MA coated nanoparticleswere synthesized by emulsifier free emulsion polymerization with the range of 150-500 nm. Cytotoxic effects of the nanoparticles both PEG/MA and MMA/AAc coated,were determined by MTT assay. Nanoparticles that syntehesized werecharacterized by FTIR, DSC, XRD and VSM. Magnetically loaded nanosorbents forisolation of Mesenchymal stem cells from cell sources, were prepared by covalentbonding of CD 105 and CD 73 mesenchymal stem cell spesific antibadies to thesynthesized nanoparticles that carries functional group (-COOH) on their surfacesaccording to optimization outcomes. Both produced nanosorbents and commercialmicrobeads (MACS/Miltenyi CD 105 Microbeads) were used in flow-through andbatch magnetic separators for isolation of mesenchymal stem cell from cellsuspension and the results were analyzed by Flow Cytometry.With this study, magnetically loaded PMMA/AAc nanosorbents for isolation ofmesenchymal stem cell from cell suspensions, and can be use in both flow-throughand batch magnetic separators, were produced.Key Words: Magnetic nanosorbents, polymerization, isolation, mesenchymal stemcell.Advisor: Prof. Dr. Erhan PİŞKİN, Hacettepe University, Chemical EngineeringDepartment.