İnsan karbonik anhidraz VII enzim geninin eE coli`de klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı antibiyotiklerin bu enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada, insan beyin cDNA'sı kullanılarak amplifiye edilen karbonik anhidraz VII (CA VII) geni Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) suşuna klonlandı. Rekombinant plazmit, koloni PCR ve sekans analizi ile doğrulandıktan sonra protein ekspresyonu için Escherichia coli BL21 (DE-3) suşuna transforme edildi. 6 saat sürede izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) indüksiyonu ile CA VII ekspresyonu gözlendi. Daha sonra hekzahistidin (6xHis) içeren füzyon protein ProbondTM nikel şelatlayıcı reçineli afinite kolonu kullanarak %48,07 verim ve 7,02 EU/mg spesifik aktivite ile yaklaşık 21 kat saflaştırma katsayısıyla saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-PAGE yapıldı. SUMO-hCA VII füzyon proteininin kütlesi 46,77 kDa olarak belirlendi. Anti-His G-HRP antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi sonucunda yaklaşık 45 kDa'luk füzyon protein tespit edildi. Ayrıca saflaştırılan rhCA VII enziminin karakterizasyonu yapılarak enzimin optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi, aktivasyon entalpisi, Q10, KM ve Vmax değerleri belirlendi. Daha sonra saf olarak elde edilen rekombinant enzim aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin etkileri araştırıldı. İnhibisyon etkisi gösteren antibiyotikler için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ile inhibisyon tipleri tespit edildi.

In this study, carbonic anhydrase VII (CA VII) was cloned into Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) strain by using cDNA of human brain and successfully expressed. The integrity of the constructed plasmid was confirmed by colony PCR and it was transformed into Escherichia coli BL21 (DE-3) strain for protein expression. CA VII expression was observed by induction of isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) for 6 hours. Then, the fusion protein containing hexahistidine (6xHis) was then purified with 7,02 EU/mg of specific activity, 48.07% of purification yield and approximately 21 of purification folds using a ProbondTM nickel chelating resin affinity column. SDS-PAGE was performed to check the purity of the purified enzyme and determine the molecular mass. The mass of the SUMO-hCA VII fusion protein was determined to be 46.77 kDa. As a result of Western blot analysis using Anti-His G-HRP antibody, fusion protein was detected approximately 45 kDa. In addition, optimal pH, optimal ionic strenght, optimal temperature, activation energy, activation enthalpy, Q10, KM and Vmax values of enzyme were determined by characterization of purified rhCA VII enzyme. Then, the effects of some antibiotics on pure recombinant enzyme activity were investigated. For antibiotics with an inhibitory effect, inhibition types were determined with Ki constants using Lineweaver-Burk graphs.