Termofilik Thermus sp. NCCB 100425T esterazının saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Thermus sp. NCCB 100425T bakteriyal esterazı amonyum sülfat çöktürmesi ile ön saflaştırma işlemine tabi tutulduktan sonra, hidrofobik etkileşim kromatografisi ile tam olarak saflaştırıldı ve saf enzim biyokimyasal olarak karakterize edildi. Enzimin saflığı, doğal- ve SDS-PAGE kullanılarak ortaya konuldu. p-nitrofenil asetat (pNPA) substratı varlığında, enzimin optimum pH?sı 7,5, optimum sıcaklığı ise 60 °C olarak belirlendi. Yapılan kinetik çalışmalar sonucunda, pNPA substratı varlığında Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 18,32 mM ve 96,15 U/mg protein olarak belirlendi. pH 4,0-9,0 arasında, 4 °C?de inkübasyona bırakılan saf enzimde aktivitenin 7. günün sonunda bütün pH?larda %85-90 oranında, 60 °C?de 7. günün sonunda ise pH 8,0?de %59±5,2 oranında korunduğu gözlendi. 30-60 °C?ler arasında 7 gün boyunca inkübe edilen enzimin orijinal aktivitesinin yaklaşık %80?ini koruduğu gözlendi. %10 nihai konsantrasyondaki etanol ve DMSO varlığında, enzim maksimum aktivitesinin %96±2,7 ve %78±2,5?ine sahip oldu. Ayrıca bazı metal iyonlarının enzim aktivitesini farklı oranlarda etkilediği tespit edildi. Bu sonuçlar, oldukça pH ve ısıl kararlı bir enzim olan Thermus sp. NCCB 100425T esterazının bazı endüstriyel ve/veya klinik uygulamalarda kullanılabilecek bir potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir.

In this study, Thermus sp. NCCB 100425T esterase was purified using ammonium sulphate precipitation and hydrophobic interaction chromatography and then characterized biochemically. The purity of the enzyme was observed as a single band on native- and SDS PAGE. In the presence of p-nitrophenyl acetate (pNPA) as a substrate, the optimum pH and temperature of the enzyme were found to be 7.5 and 60 °C, respectively. In the presence of pNPA, Km and Vmax values are calculated as 18.32 mM and 96.15 U/mg protein, respectively. pH stability was investigated in the range of pH 4.0-9.0 at 4 °C and 60 °C. After 7 days incubation, activity of pure enzyme was retained 85-90% for all pH at 4 °C and %59±5,2 for pH 8.0 at 60 °C. It was determined that approximately 80% of enzyme activity was retained between 30-60 °C after 7 days incubation. In the presence of 10% ethanol and DMSO, the enzyme activity was retained 96±2.7% and 78±2.5%, respectively. Additionally, it was detected that some metal ions affect the enzyme activity at different ratios. It is clear from the present results that Thermus sp. NCCB 100425T esterase might have advantages for industrial and/or clinical applications in terms of especially its high thermal- and pH-stability.