Yabani ve yenilebilir bir mantar olan lactarius eucalypti O. K. Mill & R. N. Hilton` dan polifenol oksidazın saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, polifenol oksidaz (PFO), yabani ve yenilebilir bir mantar olan Lactarius eucalypti'den, Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite jeli kullanılarak, afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve biyokimyasal olarak karakterize edildi. Saf enzim elüatında PFO'ın varlığı, doğal ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezlerinde tek bir bant halinde ortaya konuldu. 4-metilkatekol (4-MK) substratı varlığında enzimin optimum pH'sı 5,0, L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) ve 3-(3,4-dihidroksifenil) propiyonik asit (DHPPA) substratı varlığında 7,0 olarak belirlendi. Optimum sıcaklığı, 4-MK ve L-DOPA substratları varlığında 20ºC, DHPPA substratı varlığında 30°C olarak belirlendi. Enzimin ısıl kararlılık profili incelendiğinde substratları için optimum sıcaklıklarında bir saatlik inkübasyon sonucu aktivitesini %60 koruduğu gözlendi. L. eucalypti PFO'sunun 4-MK ile pH 5,0, DHPPA ve L-DOPA ile pH 7,0'de 24 saat inkübasyon sonucu oldukça kararlı bir profile sahip olduğu gözlendi. Yapılan kinetik çalışmalar sonucunda, Vmaks ve Km değerleri sırasıyla, 4-MK, DHPPA, L-DOPA substratları varlığında 2500, 2000, 1666 U/mg protein ve 0,25, 0,4, 0,83 mM olarak belirlendi. PFO için elde edilen I50 değerlerine göre, askorbik asitin L. eucalypti PFO'su üzerinde en etkili inhibitör olduğu gözlendi. Ayrıca bazı metal iyonlarının PFO aktivitesine farklı şekillerde etkilediği tespit edildi. Çalışmalar sonucu elde edilen veriler, bu enzimin bir çok endüstri alanı için faydalı olabileceğini göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Lactarius eucalypti, Polifenol Oksidaz, Afinite Kromatografisi, Karakterizasyon, Saflaştırma

In this study, a polyphenol oxidase (PPO) was purified from wild edible mushroom, Lactarius eucalypti O. K. Mill & R. N. Hilton, by using a Sepharose-4-B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity column and characterized biochemically. The purified enzyme was appeared as a single band on native- and SDS- polyacrylamide gel electrophoresis. Optimum pH and tempetature the purified enzyme were found to be 5,0, and 20ºC for 4-methlycatechol (4-MC), 7,0 and 20ºC for L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and 7,0 and 30ºC for 3-(3,4-dihydroxyphenyl) propionic acid (DHPPA), respectively. Having studied the thermal stability of the purified enzyme, it was conserved the activity approximately 60% in their optimum temperature in presence of the all substrate after an hour incubation. It was observed that L. eucalypti PPO very stabile at pH 5,0 with 4-MC, at pH 7,0 with DHPPA and L-DOPA after 24 hour incubation. In the presence of, 4-methlycathecol , L-DOPA and DHPPA as a substrate, Vmax and Km values were calculated as 2500, 2000, 1666 U/mg and 0,25, 0,4, 0,83 mM, respectively. According to I50 data, ascorbic acid was found most effective inhibitor on the L. eucalypti PPO activity. In addition, some metal ions affect the enzyme activity at different concentrations. The findings from the present study showed that this enzyme can be used for some industrial purposes.Key Words: Lactarius eucalypti, Polyphenol Oxidase, Affinity Chromatography, Characterization, Purfication