Jack bean (Canavalia ensiformis) üreazın izolasyonu ve afinite teknikleri kullanılarak saflaştırılması

Abstract

Jack bean, modern biyokimyaya çok büyük katkıda bulunan ilginç proteinlerin kaynağıdır ve bunların başında da ?Üreaz (E.C.3.5.1.5)? gelir. Üreaz, doğadaki rolü ve bulunuşundan dolayı kapsamlı çalışmaların bir parçası haline gelmiştir.İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi (İMAK) terapötik proteinlerin, peptidlerin, nükleik asitlerin, hormonların ve enzimlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan bir analitik ayırma yöntemidir. Metallerin düşük maliyetleri ve metal şelatlayıcı kapasitesinde azalma olmaksızın sorbentin yüzlerce kez kullanılabilmesi metal afinite separasyonun önemli avantajlarındandır.Son yıllarda biyolojik moleküllerin saflaştırılması amacıyla süpermakrogözenekli monolitik kolonların kromatografi ortamı olarak kullanılmasına yönelik çalışmalar önem kazanmıştır. Süpermakrogözenekli monolitik kolonlar, diğer bir deyişle kriyojeller, gözenek çapı 100 ?m'ye kadar çıkan, birbirleriyle bağlantılı gözeneklere sahip ve bundan dolayı düşük basınç düşmesi gösteren yeni nesil kromatografik taşıyıcılardır. Kriyojellerin gözenek yoğunluğu ve geniş gözeneklere sahip olması düşük akış direnci sağladığından viskoz ortamlar ile çalışıldığında büyük avantaj sağlamaktadır.Bu çalışmada poli(HEMA-MAH) temelli kriyojeller destek malzemesi olarak kullanılarak İMAK yöntemiyle Jack bean üreaz (JBU) saflaştırılmış ve aktivitesi tayin edilmiştir. Tohumlardan elde edilen özütteki JBU molekülleri için maksimum adsorpsiyon kapasitesi kuru adsorbent birim gram ağırlığı başına 67.76 mg olarak bulunmuştur. JBU'nun kriyojel kolondan elüsyonu için 20 mM fosfat tamponu içinde 1 M NaCl (pH 8.0) kullanılmıştır. İMAK sonucu elde edilen JBU'nun moleküler ağırlığı ve saflığı standart protein markırları (Sigma) ile karşılaştırılarak SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile belirlenmiştir. Ayrıca poli(HEMA-MAH)-Cu2+ kriyojel kolona pH 7.0 fosfat tamponu içinde çözünmüş JBU çözeltilerinden JBU adsorbe edilmiş ve maksimum adsorpsiyon kapasitesi kuru adsorbent birim gram ağırlığı başına 23.17 mg olarak bulunmuştur. JBU'nun adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmadan poli(HEMA-MAH)-Cu2+ kriyojel kolona tekrar tekrar adsorbe ve desorbe edilebileceği gösterilmiştir.

Jack bean is the source of interesting proteins that contributes to modern biochemistry and urease is the primary of these proteins. Owing to its role and occurance in nature, urease has become a part of extensive studies.Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) is an analytic separation method that is widely-used for the purification of therapeutic proteins, peptides, nucleic acids, hormones and enzymes. Low cost of metals and using of sorbent hundreds of times without decreasing metal chelating capacity are the main advantages of metal affinity separation.In recent years, for the purpose of purification of biological molecules, using of monolithic columns as chromatographic media has become important. Supermacroporous monolithic columns, so-called cryogels are new generation chromatographic matrices which have interconnected pores up to 100 ?m in diameter and accordingly have low back-pressure. Cryogels provides big advantages because of their intensive and large pores when they are used in viscous media.In this study, JBU was purified by IMAC techniques by using poly(HEMA-MAH) based cryogels as a support material and its activity was determined. Maximum adsorption capacity of JBU molecules obtained from the extract was determined to be 67.76 mg per dry gram of adsorbent. Elution of JBU from cryogel column was accomplished by 1 M NaCl in 20 mM phosphate buffer (pH 8.0). Molecular weight and purity of JBU purified by IMAC was determined by SDS-PAGE comparing with standart protein markers (Sigma). Also, JBU adsorption onto poly(HEMA-MAH)-Cu2+ cryogel column from aqueous JBU solutions was investigated and maximum adsorbent capacity per dry gram of adsorbent was found to be 23.17 mg. It was observed that JBU could be repeatedly adsorbed and desorbed with poly(HEMA-MAH)-Cu2+ cryogel column without significant decrease in column capacity.