Şap virüsü üretiminde kullanılan BHK-21 An30 hücrelerinin kesikli üretim prosesinde karıştırıcılı biyoreaktör işletme parametrelerinin optimizasyonu

Abstract

Sunulan tez çalışmasının amacı; şap virüsü üretiminde kullanılan ve karıştırıcılı biyoreaktörlerde kesikli üretim yöntemiyle süspanse olarak üretilen BHK-21 An30 hücrelerinin anahtar işletme parametrelerinin saptanması, etki derecelerinin belirlenmesi ve optimizasyonudur. Çalışma kapsamında kritik işletme parametreleri olarak; karıştırma hızı (N), çözünmüş oksijen (ÇO), pH ve başlangıç hücre sayısı (X0) ele alınmıştır.Bu çalışmada anahtar işletme parametrelerinin birbirleriyle olan ilişkilerinin, maksimum hücre sayısına (X), 146S partikül miktarına, hücre özgül üreme hızına (µ), antijenik titreye (AT), enfektif titreye (IT), laktat/glikoz oranına (Ylak/gli), amonyak oluşum hızına (NH3) ve toplam protein (TP) miktarına etkilerinin tespiti ve değerlendirilmesi amacıyla Design Expert 7.0 (deneme sürümü) programı ile istatistiksel deney tasarımı gerçekleştirilmiş ve matematiksel modeller geliştirilmiştir.Çalışmanın birinci aşamasında ön deneyler yapılarak biyoreaktör sistemi hazırlanmış ve çalışma yöntemi belirlenmiştir. İkinci aşamada Design Expert 7.0 yardımıyla istatistiksel deney tasarımı gerçekleştirilmiştir. Deneylerde tekrarlı-kesikli (repeated batch) üretim yöntemi uygulanmıştır. Deneyler sırasında alınan numunelerin glikoz, laktat, amonyak analizleri ve pOsm ölçümleri yapılmış, canlı hücre derişimleri yardımıyla hücre üreme eğrileri oluşturularak özgül üreme hızları (µ) ve ikilenme zamanları (td) hesaplanmıştır. Her deney sonunda alınan hücreler 1 L biyoreaktörlerde virüs ekimi ve kültürü yapılmak üzere Şap Enstitüsü Virüs Kültürü Laboratuarına gönderilmiştir. Üretilen virüslerden alınan numunelerin; 146S, AT, IT ve TP tayinleri yapılmıştır.Çalışmalar sonunda hücre derişimini (X) maksimum yapan optimum işletme koşulları ile 146S partikül miktarını maksimum yapan optimum işletme koşullarının farklı olduğu anlaşılmış ve maksimum verim için her iki amaç fonksiyonun birlikte değerlendirilmeleri gerektiği görülmüştür. İstatistik programının optimizasyon özelliği ile X ve 146S ortak çözüm yapılmış ve maksimum verimin elde edileceği parametre değerleri tespit edilmiştir. Bu değerler kullanılarak yapılan deneylerle X ve 146S partikülü miktarı için oluşturulan istatistiksel modeller valide edilmiştir.Modelin öngördüğü optimum nokta işletme parametreleri; çözünmüş oksijen ÇO=%25±5 (T=37 ºC sıcaklıkta, saf sudaki hava doygunluğuna göre), pH=7.00±0.05, karıştırma hızı N=180±20 d/dk, ve başlangıç hücre derişimi Xo=0.65±0.05x106 hücre.mL-1 olarak bulunmuştur. Modelin önerdiği son hücre sayıları (X) yapılan doğrulama (validation) deneylerinde ulaşılan hücre sayıları ~%95 uyum göstermiştir. BHK-21 hücresi için optimum nokta deney sonuçları; X6M1=3.36±0.16x106 hücre.ml-1, X6M2=5.75±0.25x106 hücre.ml-1, 146S=0.94±0.30 µg.ml-1, ?=0.0614±0.0036 sa-1, td=11.30±0.66 sa (ikilenme süresi), Ylak/gli=1.37±0.10 mol lak/mol gli, qO2=0.15±0.04*10-6 µmol O2.hücre-1.h-1 (özgül oksijen tüketim hızı), qgli=2.47±0.47*10-10 mmol.hücre-1.sa-1 (özgül glikoz tüketim hızı), qlak=3.85±1.05*10-10 mmol.hücre-1.sa-1 (özgül laktat oluşum hızı), qNH3=4.42±0.40*10-11 mmol.hücre-1.sa-1 (görünen özgül amonyak oluşum hızı) olarak hesaplanmıştır.Çalışmanın sonucunda, biyoreaktör işletme parametrelerinin hücre metabolizmasını etkileyerek X, 146S, µ, AT, IT, Ylak/gli, NH3 oluşum hızı ve TP'yi değiştirdiği ve bu ilişkilerin modellenebildiği görülmüştür. Bu veriler ışığında hücre ve virüs üretiminde önemli miktarda artışın sağlanabileceği ortaya konulmuştur.Anahtar Kelimeler: BHK-21, 146S partikülü, pH, ÇO, FMDV, optimizasyon

The purpose of this study is to optimize the stirred tank bioreactor operational parameters for batch production processes of BHK-21 An30 cells in FMD virus production. Determining the effects of bioreactor operational parameters on the BHK-21 suspension culture was aimed. Stirring speed (N), dissolved oxygen (DO), pH and initial cell density (X0) were focused on as parameters in this study.To understand and evaluate the interaction of the parameters and its relation of final cell concentration (X), amount of 146S particle, net specific growth rate (µ), antigenic titer (AT), infective titer (IT), lactate/glucose rate (Ylac/glu), ammonia production rate (NH3) and total protein (TP) math models were developed by Design Expert 7.0 (demo version) statistical program.First step of the study was the preparation of the bioreactor system and study methods. Second step was the design of the experiments by the aid of Design Expert 7.0 statistical program. 30 experiments were established for four key operational parameters. Experiments were done by repeated-batch process. Samples were taken during experiments and glucose-lactate analyses were done and pOsm was measured. The cell growth curves were plotted for cell counts and µ, td (doubling time) values were calculated. After finishing each batch culture, the cells were sent to the FMD Institute Virus Laboratory for virus inoculation and cultivation. When the virus propagation process finished the samples were taken for the tests. The samples were tested for the determination of 146S particle, IT, AT and TP.The study revealed that the operational parameters of a bioreactor are very important and not same for X and amount of 146S particle. The values of the operational parameters for maximizing both X and 146S particle were determined by the statistical model. The model validated by the executed experiments held optimum operational values of the parameters for X and 146S particle.Optimum operational values of parameters are %25±5, 7.00±0.05, 180±20 rpm and 0.65±0,05x106 cell.mL-1 due to the DO (air saturated in DEI water at 37 oC), pH, N, Xo respectively. The model worked quite well for the maximum cell yield and validation experiments for X showed approximately 95% confidence limits. These are the calculated results; X6M1=3.36±0.16x106 hücre/ml, X6M2=5.75±0.25x106 hücre/ml, 146S=0.94±0.30 µg.ml-1, ?=0.0614±0.0036 sa-1, td=11.30±0.66 sa (doubling time), Ylak/gli=1.37±0.10 mol lak/mol gli, qO2=0.15±0.04*10-6 µmol O2.hücre -1.h-1 (specific oxygen consumption rate), qglu=2.47±0.47*10-10 mmol glucose.hücre-1.sa-1 (specific glucose consumption rate), qlac=3.85±1.05*10-10 mmol lactate.hücre-1.sa-1 (specific glucose production rate), qNH3=4.42±0.40*10-11 mmol ammonia.hücre-1.sa-1 (apparent specific ammonia production rate ).Resulting from the study, bioreactor operational parameters are much affect on cells and they affects X, 146S, µ, AT, IT, Ylak/gli, NH3 production rate and TP by changing cell metabolism and and establishing models for these parameters is realistic. As a result it is possible to increase about BHK-21 cell and FMDV production capacity.Keywords: BHK-21 cell culture, 146S particle, pH, ÇO, FMDV, optimization