Altın kaplı magnetik nanopartiküller ile hücre transfeksiyonu

Abstract

Gen terapi son yıllarda genetik bozuklulukların ve kanserin tedavisinde potansiyel yöntem olarak önemli ilgi çeken yaklaşımlar arasındadır. Hedef geni taşıyan plazmid DNA nın aktarımı için hem viral hemde viral olmayan vektörler kullanılır. Viral vektörler çok etkindirler ancak ciddi yan etkileri vardır. Farklı formdaki viral olmayan vektörler çok daha emniyetlidirler ancak transfeksiyon etkinlikleri düşüktür. Devam eden çeşitli çalışmalarda daha etkin viral vektörlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Gen transferini fiziksel yöntemlerle de yapmak mümkündür. Ancak bunların da sınırlamaları vardır. Sunulan çalışmada birleştirilmiş bir stratejik yaklaşımın geliştirilmesi amaçlanmıştır. Burada farklı materyallerden (esas olarak polimerler) üretilen nanopartiküllerin benzeri, pozitif yüklü nanopartiküller kullanılarak ve ilave olarak da magnetik güç uygulanarak plazmid DNA taşıyan nanopartiküllerin hedef hücreler tarafından alımı sağlanmıştır.Bu çalışmada önce yaklaşık 90 nm boyutlu ?manyetit? (Fe3O4) nanopartiküller sentezlenmiştir. Bu manyetit nanopartiküllerin manyetik özelliklerini tümüyle kaybetmeden altın ile kaplanması sağlanmıştır. Altın yüzeylere pozitif yük kazandırmak amacıyla, bu altın kaplı nanopartiküller ?kendiliğinden yerleşen tek tabaka? (?self-assembled monolayers?-SAMs) oluşturmak amacıyla bu kabiliyete sahip iki uçlarında iki farklı fonksiyonel grup taşıyan (SH ve NH2) moleküller ile etkileştirilmiştir. Bu moleküllerin SH gruplarıyla altın yüzeylere tek tabaka oluşturacak şekilde yerleşmeleri diğer uçlarındaki NH2 grupları nedeniyle pozitif yük sağlamaları öngörülmüştür. Yüzey yükleri optimize edilmiştir. Bu nanopartiküllerin transfeksiyon verimlerinin araştırılması için yeşil florasan protein (GFP) ekprese eden plazmid DNA (PEGFP-N2) kullanılmıştır. Plazmid DNA standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak E. Coli bakterisinde çoğaltılmış ve saflaştırılmıştır. Farklı miktarlarda nanopartiküller plazmid DNA ile etkileştirilerek konjugatlar oluşturulmuştur. Bu konjugatların ve uygulanan manyetik alanın hücrelere sitotoksititesi araştırılmıştır. Bu konjugatların hücre transfeksiyon etkinlikleri ve buna uygulanacak manyetik kuvvetlerin etkileri hücre kültür ortamlarında hücre hatları kullanılarak araştırılmıştır.Anahtar Kelimeler: Gen terapi; Plazmid DNA aktarımı, viral olmayan vektörler; altın kaplı manyetit nanopartiküller; kendiliğinden tek tabakalar; transfeksiyon, Manyetik kuvvetler.

Gene therapy is attracting significant attention recently as a potential method for treating mainly genetic disorders and cancer through different approaches. Both viral and non-viral vectors have been used for delivery of plasmid DNA carrying the target gene. Viral vectors are very effective, however they can cause serious side effects. Non-viral vectors in different forms are much more safe, but their transfection efficiencies are low. Development of more effcient non-viral vectors have been aimed. Gene transfer is also possible by physical means. However they do also exhibit limitations. This study attempts to develop a combined strategy in which both positively charged nanoparticle similar to existing nanoparticles made of different materials (mainly polymers) are using and in addition magnetic forces is applied to increase the uptake of nanoparticles carrying the plasmid DNA by the target cells.In this study, ?magnetite? (Fe3O4) nanoparticles with about 90 nm in diameter were synthesized. These magnetic nanoparticles were coated with a gold layer without loosing their magnetic properties. These gold coated nanopraticles were interacted with ?self-assembled monolayers?-SAMs forming molecules carrying two different functional groups (SH and NH2). These molecules were assembled on the gold surface as SAMs via SH groups while NH2 groups give the positive charge to the nanoparticles. Surface charges were optimized. In order to obtain the transfection yield of these nanoparticles plasmid DNA (PEGFP-N2) expressing green fluoresence protein was used. Plasmid DNA were purchased and multiplied in E.Coli and then purified by using standart molecular biological techniques. Conjugates were formed by interacting of different amounts of nanoparticles with plasmid DNA. Cytotoxicity of conjugates and applied magnetic force were investigated. Cell transfection efficiencies of these conjugates and the effects of the magnetic forces were investigated in cell culture media using cell lines.Keywords: Gene therapy; Plasmid DNA delivery; Nonviral vectors; Gold coated magnetite nanoparticles; Self-assembyling monolayers; transfection; magnetic forces.Advisor: Prof.Dr. Erhan Bişkin, Hacettepe University, Bioengineering Division Prof.Dr. Tülin Kutsal, Hacettepe University, Bioengineering Division;