Azurin proteininin Pichia pastoris ile rekombinant üretimi

Abstract

Bu çalışmada Pichia pastoris ekspresyon sisteminde sıklıkla kullanılan ve metanolle indüklenebilen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında azurin proteininin üretimi gerçekleştirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa genomik DNA'sı kullanılarak amplifiye edilen ve pPICZαA ekspresyon vektörüne yerleştirilen azurin geni, E. coli One Shot TOP10 hücrelerinde klonlanmış ve lineer hale getirilen rekombinant vektör, P. pastoris X-33 hücrelerine transfer edilmiştir. Genomlarında azurin geninin çoklu kopyasını taşıyan kolonilerin seleksiyonu için antibiyotik direnç testi ve koloni PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Seçilen rekombinant transformantların protein üretim kapasiteleri karşılaştırılmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat inkübasyona bırakılan hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerlerine inoküle edilmiştir. İnkübasyon sonrası santrifüjle çöktürülen hücreler, %0,5 metanol ve %1 sorbitol içeren üretim besiyerlerine aktarılarak 48 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonra kültür ortamlarına promotör indükleyicisi olarak %0,5 metanol ilave edilmiştir. İnkübasyon sonrası elde edilen kültür süpernatantları ve hücre lizatları ile gerçekleştirilen Western blot analizi ile transformantların tümünde rekombinant proteinin hem ekstrasellüler hem de intrasellüler üretimi gözlenmiştir. Ayrıca her iki üretim tipine göre, 1. koloniyi oluşturan hücrelerin protein üretim kapasitesinin diğer kolonileri oluşturan hücrelerin üretim kapasitesinden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Rekombinant P. pastoris hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler azurin proteininin molekül kütlesinin yaklaşık 20 kDa olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, P. pastoris hücrelerinde azurin proteininin ekspresyonu ilk kez gerçekleştirilmiştir.

In this study, the production of azurin protein under the control of the AOX (alcohol oxidase) promoter, which is frequently used in the Pichia pastoris expression system and can be induced by methanol, was performed. The azurin gene amplified using the Pseudomonas aeruginosa genomic DNA and inserted into the pPICZαA expression vector was cloned in E. coli One Shot TOP10 cells and linearized recombinant vector was transferred to the P. pastoris X-33 cells. Antibiotic resistance test and colony PCR reaction were performed for the selection of colonies containing multicopy of the azurin gene in their genomes. Protein production capacity of selected recombinant transformants was compared. The cells incubated for 48-72 hours in solid medium were inoculated into pre-culture media containing glycerol. After incubation, centrifuged cells were transferred to the production media containing 0.5% methanol and 1% sorbitol, and incubated for 48 hours. After 24 hours, 0.5% methanol, as promoter inducer, was added to the culture media. Both extracellular and intracellular production of the recombinant protein was observed in all of the transformants by Western blot analysis performed using culture supernatants and cell lysates which were obtained after incubation. In addition, according to both types of production, it was observed that the protein production capacity of the cells constituting the 1st colony was higher than the production capacity of the other colonies. The molecular mass of the extracellular azurin protein produced by recombinant P. pastoris cells was found to be about 20 kDa. Expression of azurin protein in P. pastoris cells was performed for the first time in this study.