Okratoksin a tayini için nanolif kaplı kütle hassas immünosensör hazırlanması

Abstract

Mikotoksinler olarak adlandırılan toksik mantar metabolitleri yiyeceklerin kontaminasyonunun temel sebebi olarak uzun zamandır bilinmekte ve kanser, tümör gibi tehlikeli hastalıklar oluşturabilmektedir. Bir mikotoksin çeşidi olan okratoksinler Aspergillus ve Penicillium mantar türleri tarafından üretilmektedir. Okratoksin üreten mantarlar en çok arpa, mısır, buğday, yulaf, çavdar, yerfıstığı, üzüm suyu, şarap, kakao, kuru meyveler, baharatlar gibi besin maddelerinin üzerinde bulunur. Bu grubun ana toksini insanlarda kansere ve böbrek hasarlarına yol açan Okratoksin A (OTA)' dır. Ülkemizde yetiştirilen tarım ürünlerindeki OTA varlığı ve bu mikotoksinin düşük miktarlarının insan sağlığına sebebiyet verdiği zararlar nedeni ile getirilen yasal sınırlamalar hassas tekniklerle OTA tayini gerekliliğini arttırmıştır. Mikotoksin tayininde kullanılan yurt dışı kaynaklı cihazların analiz süresi uzundur, pahalı bir sistemdir ve analiz için teknik elemana ihtiyaç duyulmaktadır. Bu yüzden bu çalışmada mikotoksin tayini için; kısa sürede cevap veren, pahada ucuz ve sahada uzman personele ihtiyaç duymadan düşük derişimlerdeki mikotoksin seviyelerini algılayabilen bir biyosensör tasarlanması hedeflenmiştir.Biyosensörün tanıyıcı tabakasındaki antikor ve ortamda bulunan antijen etkileşiminin meydana getirdiği kütle değişimleri QCM ile çok hassas ölçülebilir. Bu çalışmada, QCM altın yüzeyleri, yüzey alanını arttırmak için elektro-eğirme yöntemi ile selüloz asetat (CA) nanoliflerle kaplanmıştır. Böylece antikor-antijen etkileşimine dayanarak oluşturulan OTA tayini için hazırlanan kütle hassas immünosensörün yüzey alanı, dolayısıyla hassasiyeti arttırılmıştır. 1 mg/ml OTA antikoru (anti-OTA) ya kontrol olarak hazırlanan boş QCM'e ya da elektro-eğirilmiş CA kaplı QCM'e (ES-QCM) kimyasal olarak aktifleştirilmiş aldehit grupları aracılığı ile immobilize edilmiştir. Boş QCM'in altın yüzeyleri çapraz bağlayıcı olan sisteamin ve glutaraldehit ile aldehit grubu elde etmek üzere aktifleştirilmiştir. Anti-OTA immobilizasyonundan sonra, boş QCM'lerin performansları BSA bağlı OTA (OTA-BSA) (10-250 ng/ml) ile test edilmiştir. ES-QCM' ler için lif oluşturmak amacı ile hazırlanan selüloz asetat polimer çözeltisi kütlece %15 oranında CA ve kütlece 3:1 oranında aseton/N,N dimetilasetamit içermektedir. Oluşturulan liflerin ortalama çapı 200 nm civarındadır. Aldehit grupları CA liflerde sodyum periyodat oksidasyonu ile oluşturulduktan sonra liflere antikor immobilize edilmiştir. ES-QCM'in performansını test etmek için ise OTA (0,5-20 ng/ml) ya da BSA-OTA (10-250 ng/ml) kullanılmıştır. Yüzeye adsorblanan OTA miktarı, toksin bağlanmaları ile oluşan frekans kaymaları hesaplanarak belirlenmiştir. Boş QCM'in ve ES-QCM'in kalibrasyon eğrileri doğrusallıkları açısından karşılaştırılmış, ES-QCM' in algılama limiti belirlenmiştir. Hazırlanan immünosensörün seçiciliği `sitrinin` (100,250 ng/ml) ile test edilmiş, anti-OTA ile arasında etkileşim gözlenmemiştir.

Toxic fungal metabolites, socalled mycotoxins, have long been recognized as the major cause of feed toxicosis, and may also constitute a serious hazard to human health such as cancer and tumour. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by several species of Aspergillus and Penicillium. OTA can be found in foods such as corn, wheat, oat, rye, peanut, grape juice, wine, cacao, dried fruits, spices. This group's main toxin is ochratoxin A which causes cancer in humans and kidney damage. Determination of ochratoxin A has increased the need for sensitive techniques because of the presence OTA in agricultural products grown in our country and the legal restrictons about this toxin that is damaging to human health in small quantity. Mycotoxin analysing period is long, the system is expensive and technical staff is needed for analysis. So in this study, aim is to create a biosensor for the determination of mycotoxins that can detect lover concentrations of mycotoxin levels and also have a fast response time, portable, enable in-situ analysis without needing an expert.Mass changes caused by the interaction of antibody and antigen on the recognition layer of the biosensor can be measured with precision by QCM.In this study, quartz crystal microbalance surface was coated with cellulose acetate (CA) lif via electrospinning method for increasing the surface area. It is expected to increase the sensitivity of mass sensitive immunosensor prepared for ochratoxin A (OTA) utilizing the high selective behavior of the antigen-antibody interaction. 1 mg/ml OTA antibody (anti-OTA) was immobilized on the blank QCM as control surface or electrospun coated QCM (ES-QCM) by means of chemically active aldehyde groups. Blank QCM gold surface was activated with cysteamine and glutaraldehyde cross-linker to obtain aldehyde groups. After the anti-OTA immobilization, blank QCM's performance was tested with BSA conjugated OTA (10-250 ng/ml). For the ES-QCM, CA lifs were prepared from 15% (w/w) CA solution in acetone/DMAC (3:1). The average diameters of the CA lifs were about 200 nm. The aldehyde groups were produced in the CA lif matrix by NaIO4 oxidation. Then, anti-OTA was immobilized on the CA lifs. The antigens that bound anti-OTA on ES-QCM were OTA (0.5-20 ng/ml) or BSA conjugated OTA (10-250 mg/ml). The amount of adsorbed OTA was determined by calculating the frequency shift due to binding of toxin on the surface. The calibration curves of the blank QCM and ES-QCM were obtained and these curves were compared with in terms of linearity and the detection limit of ES-QCM was determined. Selectivity of the immunosensor was tested with OTA like molecule `citrinin` (100, 250 ng/ml) and no cross-reactivity were observed.