P3HB ve PBA polimerleri ikili karışımlarının doku iskelesi olarak değerlendirilmesi

Abstract

Tez çalışması kapsamında bir biyopoliester olan poli-3-hidroksibutirat (P3HB), hidrojen transfer polimerizasyonuyla sentezlenen ve daha önce hiçbir doku mühendisliği çalışmasında kullanılmamış olan poli-β-alanin (PBA), PBA kopolimeri poli(β-alanin-koetilenoksit) (PMBA), PBA türevi poli(N-(3-metoksipropil)-β-alanin) (PNMPBA) poliamitleri ile katkılanarak yeni bir doku iskelesi malzemesi üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu katkılama ile aynı zamanda P3HB'nin olumsuz özelliklerinin giderilmesi de amaçlanmıştır. Doku iskelesi üretimi için, dondurarak kurutma ve elektroeğirme yöntemleri kullanılmıştır.Dondurarak kurutma yöntemiyle %5 P3HB ve P3HB'ye oranla kütlece %2, %5 ve %10 oranlarında PBA, PNMPBA ve PMBA içeren P3HB 3 boyutlu (3B) süngerimsi doku iskeleleri elde edilmiştir. İskeleler üzerinde basma mekanik testleri uygulanmış, P3HB ve %2 PBA içeren doku iskelelerinde sıkıştırma direnci değerleri sırasıyla 14.00±0.00 kPa ve 5.66±1.04 kPa olarak, elastik modül değerleri ise sırasıyla 27.40±0.00 kPa ve 12.06±3.20 kPa olarak bulunmuştur. Yapılan katkılamaların P3HB'nin kristal yapısına olan etkisini araştırmak amacıyla X-ışını kırınımı (XRD) analizi gerçekleştirilmiştir. P3HB'nin kristalinitesi %52.70 olarak bulunurken; %2 PBA, PNMPBA ve PMBA katkılaması yapılmış grupların kristalinitesi sırasıyla %48.84, %42.50 ve %46.84; %5 PBA, PNMPBA ve PMBA katkılaması yapılmış grupların kristalinitesi sırasıyla %46.46, %46.01 ve %46.61;%10 PBA, PNMPBA ve PMBA katkılaması yapılmış grupların kristalinitesi ise sırasıyla %36.91, %41.21 ve %46.27 olarak bulunmuştur. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonuçları değerlendirilmiş, ve dondurarak kurutma yöntemi ile üretilen iskelelerin doku mühendisliği uygulamalarına uygun olmadığı tespit edilmiştir.Elektroeğirme aşamasında geleneksel elektroeğirme ve ıslak elektroeğirme teknikleri kullanılarak sırasıyla 2 boyutlu (2B) ve 3B fibröz doku iskeleleri elde edilmiştir. Geleneksel elektroeğirme için %5 (w/v) P3HB ve %10 PBA (w/w) hekzafloroizopropanol (HFIP) içerisinde çözdürülmüş ve elektroeğirme koşullarının optimizasyonundan sonra 15 kV voltaj, 22.5 cm şırınga-toplayıcı uzaklığı ve 1.0 mL/sa akış hızı optimum koşullar olarak belirlenmiştir. Islak elektroeğirme için ise %10 (w/v) P3HB ve %10 (w/v) PBA HFIP içerisinde çözüdürülmüş ve elektroeğirme koşullarının optimizasyonundan sonra 15 kVvoltaj, 1 mL/sa akış hızı ve 16.5 cm şırınga-toplayıcı uzaklığı koşulları seçilmiştir.Geleneksel elektroeğirme yöntemiyle üretilen %5 P3HB ve %10 PBA katkılı P3HB fiberlerin çapları sırasıyla 4.44±1.81 μm ve 3.21±1.82 μm, ıslak elektroeğirme ile üretilen %10 P3HB ve %10 PBA katkılı P3HB fiberlerin çapları ise sırasıyla 5.08±1.57 μm ve 5.12±1.63 μm olarak bulunmuştur. Çekme testleri geleneksel elektroeğirme ile üretilen 2B fibröz matrislere uygulanmıştır. İskelelerin çekme dirençleri sırasıyla 4.00 MPa ve 8.20 MPa olarak bulunurken, elastik modül değerleri sırasıyla 152.00 MPa ve 290.00 MPa olarak bulunmuştur. Ayrıca 2B iskeleler üzerinde su temas açısı ölçümleri gerçekleştirilmiştir. İskelelerin su temas açıları %5 P3HB için 88.30±19.90°, %10 PBA katkılı P3HB için 48.90±9.00°'dir. Su alım kapasitesi ölçümleri ise ıslak elektroeğirme yöntemi ile üretilendoku iskeleleri ile yapılmıştır. Üç boyutlu fibröz doku iskelelerinin su alım kapasiteleri %10P3HB için %356.70±25.00 olarak, %10 PBA katkılı P3HB için ise %443.60±101.10 olarak hesaplanmıştır.Hücresel uyumluluğun incelenebilmesi için P3HB ve PBA katkılı P3HB fibröz 3B iskelelerile MC3T3-E1 preosteoblastik hücre hattı kullanılarak hücre kültürü çalışmaları yapılmıştır.Hücre canlılığının belirlenmesi amacıyla mitokondriyal canlılık analizi (MTT) ve hücre morfolojisinin takibi için taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi gerçekleştirilmiştir.Sonuç olarak PBA katkılamasının P3HB'nin doku mühendisliği açısından olumsuzluk yaratan yüksek kristalinite, yüksek hidrofobisite gibi olumsuz özelliklerini iyileştirdiği ve mekanik açıdan olumlu özellikler katarak hücresel uyumluluğu arttırdığı tespit edilmiştir.

In the thesis study, to produce a novel tissue engineering material, a biopolyester poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) reinforced with poly-β-alanine (PBA), PBA copolymer poly(β-alanine-co-ethyleneoxide (PMBA), PBA derivative poly(N-(3-methoxypropyl)-β-alanine)(PNMPBA) polyamides, which were synthesized by hydrogen transfer polymerization, wereused for the first time in the field of tissue engineering. Elimination of negative features ofP3HB by reinforcement was also aimed. Freeze drying and electrospinning methods wereselected for the production of tissue scaffolds.Five percent P3HB and P3HB reinforced with PBA, PNMPBA and PMBA with 2%, 5% and10% by mass relative to P3HB 3-dimensional (3D) sponge-like tissue scaffolds wereobtained by freeze-drying method. Mechanical compression tests were applied on thescaffolds and the compressive strength values were found as 14.00 ± 0.00 kPa and 5.66 ±1.04 kPa, the elastic modulus values were found as 27.40 ± 0.00 kPa and 12.06 ± 3.20 kPafor the P3HB and 2% PBA scaffolds, respectively. X-ray diffraction (XRD) analysis wasperformed to investigate the effect of the reinforcement on the crystal structure of P3HB.The crystallinity of the P3HB is found as 52.70%; and the crystallinity of the 2% PBA,PNMPBA and PMBA doped groups were 48.84%, 42.50% and 46.84%; the crystallinity ofthe 5% PBA, PNMPBA and PMBA doped groups was 46.46%, 46.01% and 46.61%, thecrystallinity of 10% PBA, PNMPBA and PMBA doped groups were 36.91%, 41.21% and 46.27%, respectively. According to the characterization results, it has been determined thatthe scaffolds which produced with freeze-drying method were not suitable for tissueengineering applications.Two-dimensional (2D) and 3D fibrous tissue scaffolds were obtained by using conventionalelectrospinning and wet electrospinning techniques, respectively. For conventionalelectrospinning, 5% (w/v) P3HB and 10% PBA (w/w) were dissolved inhexafluoroisopropanol (HFIP) and 15 kV voltage, 22.5 cm syringe-collector distance and1.0 mL/h flow rate have been determined as convenient conditions after optimization ofelectrospinning conditions. For wet electrospinning, 10% (w/v) P3HB and 10% (w/v) PBAwere dissolved in HFIP and 15 kV voltage, 16.5 cm syringe-collector distance and 1 mL/hflow rate conditions were selected after optimization of the electrospinning conditions.Diameters of 5% P3HB and 10% PBA doped P3HB fibers produced by conventionalelectrospinning method were 4.44±1.81 μm and 3.21±1.82 μm, and the diameters of 10%P3HB and 10% PBA doped P3HB fibers produced by wet electrospinning were 5.08±1.57μm and 5.12±1.63 μm, respectively. Tensile tests were performed on 2D fibrous matricesproduced by conventional electrospinning. The tensile strengths of the scaffolds were foundas 4.00 MPa and 8.20 MPa, while the elastic modulus values were found as 152.00 MPa and290.00 MPa, respectively. In addition, water contact angle analysis was performed on 2Dfiber scaffolds. The water contact angles of the scaffolds were found 88.30±19.90° for 5%P3HB and 48.90±9.00° for P3HB with 10% PBA, respectively. Water uptake capacitymeasurements were performed with tissue scaffolds produced by wet electrospinning. Thewater uptake capacities of three dimensional fibrous tissue scaffolds were found356.70±25.00% for 10% P3HB and 443.60±101.10% for P3HB doped 10% PBA.Cell culture studies were carried out with P3HB and PBA doped P3HB fibrous 3B scaffoldsand MC3T3-E1 preosteoblastic cell line to examine cellular compatibility. For determiningcell viability and cell morphology mitochondrial viability assay (MTT) and scanningelectron microscope (SEM) analysis were applied, respectively.In conclusion, it has been found that PBA doping enhance P3HB's some negative propertiesin terms of tissue engineering such as high crystallinity, high hydrophobicity and it improvescellular compatibility by adding positive mechanical aspects.