Cilt yenilenmesi için yeni bir fibrin matris oluşturulması, kimyasal/fiziksel özellikleri ve doku iskelesi oluşturma potansiyeli açısından incelenmesi

Abstract

Deri hasarları, yanık veya diyabete bağlı kronik yaraların iyileştirilmesi, yaşlanmaya bağlı deride oluşan deformasyonların giderilmesi amacıyla kullanılan pek çok yara örtüsü, dolgu malzemesi ve hücre temelli doku mühendisliği ürünleri mevcuttur. Bu ürünler alerji gibi bazı istenmeyen sonuçlar doğurabilmekte ayıca pahalı ve kısıtlı iyileştirici etkiye sahip olma gibi dezavantajları bulunmaktadır. Dolayısıyla, deri yenilenmesi için etkin, risk oluşturmayan ve düşük maliyetli biyomalzemelere ihtiyaç vardır. Bu tezde, kullanımı ve elde edilmesi kolay, yeni bir fibrin matris üretimi amaçlanmıştır. Bunun için, plateletten zengin plazmadan (PZP) kolayca, kalsiyum klörür veya trombinin tek tek jel oluşturucu madde olarak kullanılmasıyla gözenekli bir matris elde edilmiştir. Bu jel matrislerin kimyasal/fiziksel özellikleriyle deri yenilenmesi için kullanılabilirliği HS27 insan fibroblast hücreleri kullanılarak araştırılmıştır.Plateletten zengin fibrin matris (PZFM), PZP' den elde edilen doğal bir iskele olarak, içerdiği çok sayıdaki platelet nedeniyle, zengin bir büyüme faktörü ve sitokin kaynağı olarak bilinmektedir. Bu çalışmada matrisler genellikle birlikte kullanılan trombin ve kalsiyum klorürün tek tek kullanımıyla oluşturulmuştur. Trombin ile ve kalsiyum klorür ile oluşturulan PZFM' ler, altmış dakikada sırasıyla, 83 ± 0,0019 ve 198 ± 0,0038 oranında şişme göstermişlerdir. Matrislerin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yapılan analizleri; bunun trombinle oluşan matris için 19,4 ± 4,74 µm ve kalsiyum klörürle oluşan matrisin 35 ± 5,8 µm olan farklı gözenek yapısından kaynaklanabileceğini göstermiştir. Trombinle oluşan PZFM' lerin 28 günde PBS ve % 10 FBS içeren DMEM içinde, kalsiyum klörürle oluşan matristen daha çok çözüldüğü belirlenmiştir. Matrislerde fibrin moleküllerinin çapraz bağlanması FTIR (Fourier transmisyon infrared spektroskopisi) ile incelenmiş ve termal dayanıklılıkları termogravimetrik analizle incelenmiştir.Bu çalışmada, PZFM iskelelerde 21 gün üretilen hücrelerin çoğalması MTT testi ile, kollajen I ve kollajen III üretimleri ise immünhistokimyasal olarak hematoksilen/eozin boyama ve geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile incelenmiştir. Matrislerde çoğalan hücreler taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülenmiştir. Fibroblastların her iki jelde de tutunup çoğaldıkları ancak sadece kalsiyum klorürle oluşturulan matrislerde üç haftalık bir sürede bütünlüklerini korudukları ve kollajen üretmeye başladıkları saptanmıştır.Sonuç olarak, üretilen üç boyutlu PZFM' lerin hücre canlılığını ve aktivitesini destekleyici özellikleriyle, deri yenilenmesini gerektiren durumlarda kullanılabileceği düşünülmüştür.Anahtar kelimeler: Plateletten zengin fibrin matris (PZFM), fibroblast, kalsiyum klorür, trombin, deri yenilenmesi

There are a considerable amount of wound dressings, fillers and tissue engineered products for the treatment of skin damages, burns, diabetic wounds or skin aging. These products sometimes lead to adverse reactions like allergy and they have the disadvantages of having high cost and limited curing effect. Therefore, there is a need for affordable biomaterials that may be used in skin regeneration efficiently without any risk.The aim of this thesis is to produce a new, cost efficient and easy to prepare kind of fibrin matrix. Therefore, a porous matrix derived from platelet-rich plasma is produced by simply using either calcium chloride or thrombin as gelling agent. The chemical/physical properties and also the potential of these matrices as a skin regenerating biomaterial is analysed using HS27 human fibroblast cells. As a natural scaffold produced from natural fibrin molecules obtained from platelet-rich plasma as PRFM is known to be a good source for growth factors and citokines due to the high number of platelets that it contains. Here, the matrix is produced by simply using calcium chloride or thrombin instead of common combined use. PRFMs obtained by thrombin had a swelling ratio of 83 ± 0,0019 in 60 minutes and calcium chloride as gelling agent. PRFM had a swelling ratio of 198 ± 0,0038 in 60 minutes. Analyses of both PRFMs by scanning electron microscopy (SEM), have revealed that this difference is due to the difference in pore sizes of calcium chloride PRFM (19,4 ± 4,74 µm) and thrombin PRFM (35 ± 5,8 µm). Thrombin unduced PRFMs degraded more than calcium chloride induced PRFM in PBS and DMEM containing 10% FBS in 28 days. The cross linking of fibrin molecules in the matrices were detected by FTIR (Fourier transformed infrared) spectroscopical analysis and their thermal resistance was measured by thermogravimetrical analysis. In this study, the cells cultured for 21 days on these PRFM scaffolds were analysed for their proliferation by MTT test and their collagen I and collagen III production by immunocytochemistry via hemotoxylin/eosin staining and transmission electron microscopy (TEM). Cells growing in the matrix were monitored by scanning electron microscopy (SEM). It is found that fibroblasts attached and proliferated in both matrices, but only the cells on calcium chloride induced matrices have remained intact and synthesized collagen in a three weeks period. It is concluded that, these three dimentional PRFMs, have cell viability and activity promoting properties and thus they may be used in situations which require skin regeneration.Key words: Platelet-rich fibrin matrix (PRFM), fibroblast, calcium chloride, thrombin, skin regeneration