Pectobacterium chrysanthemi pektin metilesteraz enziminin Pichia pastoris ile rekombinant üretimi

Abstract

Bitkilerin hücre duvarının en önemli bileşeni olan, tüm canlı bitkilerin hücre duvarında ve hücreleri arasında bulunan pektini degrade eden pektinazlar, gıda enzimlerinin küresel satışında %25'lik bir paya sahiptirler. Bu enzimlerden biri olan pektin metilesteraz (PME) enzimi, yüksek bitkilerde yaygın olarak bulunur ve metil ester gruplarını hidroliz ederek pektini deesterifiye eder. Bu tez çalışmasında Pichia pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak GAP (Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz) promotörünün kontrolü altında PME enziminin ekstrasellüler üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu doğrultuda, öncelikle ekstrasellüler üretim için pGKB ekspresyon vektörüne α-faktör sinyal sekansı yerleştirilerek pGKBα vektörü elde edilmiştir. Daha sonra Pectobacterium chrysanthemi PME gen dizisi, ticari olarak temin edilen sentetik DNA'dan amplifiye edilerek pGKBα vektörüne yerleştirilmiştir. E. coli JM109 hücrelerinde klonlanarak elde edilen rekombinant vektör (pGKBα-PME), lineer hale getirilerek LiCl metodu ile P. pastoris hücrelerine transfer edilmiştir. Genomlarında PME genini taşıyan maya transformantlarının belirlenebilmesi için seçilen kolonilerden saflaştırılan genomik DNA'lar kullanılarak PCR yapılmıştır. PME genini taşıyan pozitif kolonilerin üretim besiyerinde 72 saatlik inkübasyonu ile protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Konsantre edilen kültür sıvıları agaroz plak kuyularına yüklenerek aktivite zonu oluşumuna bakılmıştır. En büyük zon oluşumuna sahip koloniye ait kültür sıvısında SDS-PAGE analizi ile proteinin varlığı belirlenmiştir.

Pectinases which degrade pectin, the most important component of the cell wall of plants and exist in between cells of all living plants, account for 25% of the global food enzymes. One of these enzymes, pectin methylesterase (PME) exists widely in higher plants and de-esterifies pectin by hydrolyzing methyl ester groups. In this thesis study, PME enzyme was produced extracellularly under the control of GAP (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) promoter using Pichia pastoris expression system. Accordingly, the pGKBα vector was obtained by inserting the α-factor signal sequence into the pGKB expression vector for extracellular production. Then, Pectobacterium chrysanthemi PME gene sequence was amplified from synthetic DNA and inserted into the pGKBα vector. The recombinant vector (pGKBα-PME) obtained by cloning in E. coli JM109 cells was linearized and transferred into P. pastoris cells by LiCl method. PCR was performed using genomic DNA purified from selected colonies to identify the yeast transformants carrying the PME gene in their genomes. Positive colonies carrying the PME gene were used to produce protein in the production medium for 72 hours. Concentrated culture solutions were filled in the wells of agarose plate to determine activity haloes. The presence of protein was determined by SDS-PAGE analysis in the culture solution of the colony with the largest halo.