Yaygın fiğ (Vicia sativa L.) çeşitlerinde mikroçoğaltım ve Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla Cry1Ac, Cry2A ve bar genlerinin aktarılması

Abstract

Protein, mineral maddeler ve vitaminler bakımından oldukça zengin olan yaygın fiğ bitkisi (Vicia sativa L.)'de rejenerasyon ve genetik transformasyon büyük bir sorun olarak görülmektedir. Bu tez kapsamında yaygın fiğin Cumhuriyet 99, Karaelçi, Kubilay 82 ve Selçuk 99 çeşitlerinde sürgün rejenerasyonu ve A. tumefaciens aracılığıyla transgenik bitki elde edilmesi hedeflenmiştir. Yaygın fiğin dört çeşidinde yüzey sterilizasyonda farklı oranlarda çamaşır suyu kullanılmıştır. Daha sonra sürgün rejenerasyon çalışmalarında farklı oranlarda BAP + NAA içeren MS ortamında, yarım ve tam kotiledon boğum eksplantı kullanılarak rejenerasyon sistemi geliştirilmiştir. Adaksial ve abaksial şekilde kültüre alınmış kotiledon eksplantları arasında sürgün rejenersyonun bakımından adaksial şekilde kültüre alınmasının daha uygun olduğu görülmüştür. Her dört yaygın fiğ çeşidinde, BAP, SA, GA3 ve BAP + GA3'nın tohumlara priming olarak uygulanmasının sürgün oluşumuna olumlu etkileri izlenmiştir. Olgunlaşmamış embriyo eksplantlarında, farklı oranlarda BAP + NAA içeren MS ortamlarında da sürgün rejenerasyonu üzerine etkileri incelenmiştir. Yukarıda belirtilmiş tüm denemelerden elde edilen sürgünler, 0.75 µg/ml IBA içeren MS ortamda köklendirilmiş ve dış koşullara adaptasyonda başarı sağlanmıştır. A. tumefaciens'in GV2260 GUS INT, LBA4404 pTF101 AopR1 Cry1Ac bar, LBA4404 Cry2A, GNA, C58C1 pGreen AopR1 Cry1Ac bar ve C58C1 pGreen 35S Cry1Ac bar hatlarıyla embriyo, hipokotil ve koltuk altı meristem eksplantı kullanarak Selçuk 99 ve Kubilay 82 çeşitlerine gen aktarım yapılmış, T0 ve T1 generasyonuna kadar tohum ve transgenik bitkiler elde edilmiştir. Gen aktarım çalışmasından elde edilen sonuçlar, GUS tesi, PCR testi ve biyoassay ile de doğrulanmıştır.

Protein, minerals and vitamins rich common vetch (Vicia sativa L.), is very difficult to regenerate and transform genetically. This thesis aimed to develop protocols for shoot regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the plants using common vetch cultivars Cumhuriyet 99, Karaelçi, Kubilay 82 and Selçuk 99. These cultivars were surface sterilized using different concentrations of commercial bleach. Thereafter, a regeneration system from ½ and fully developed cotyledon node explants was developed using different concentrations of BAP + NAA in MS medium. Comparing shoot regenration system on adaxially and abaxially cultured cotyledon explants on different concentrations of BAP in MS medium, it seemed as adaxillay cultured explants were more productive. Priming of seeds with different concentrations of BAP, SA, GA3 and BAP + GA3 showed positve effects on regeneration. Similarly, different concentrations of BAP + NAA were used to regenerate immature embryo explants positively. Shoots regenerated on all of the above mentioned experiments were rooted on MS medium containing 0.75 µg/ml IBA and acclimetised to external environmental conditions. Successful genetic transformation was after treatment of embryo, hypocotyl and stem node explants from common vetch cv. Selçuk 99 and the Kubilay 82 with GV2260 GUS INT, LBA4404 pTF101 AopR1 Cry1Ac bar, LBA4404 Cry2A , GNA, C58C1 pGreen AopR1 Cry1Ac, bar and C58C1 pGreen 35S Cry1Ac bar lines of A. tumefaciens. Successfully transformed plants were used to obtain T0 and T1 generations, that floered and set seeds. The results were confirmed using GUS test, PCR test and bioassay.