Yumurtaya verilen aflatoksin B1 (AFB1)`in tavukların lenfoid organlarının embriyonal gelişimi üzerindeki etkilerinin enzim histokimyasal yöntemlerle araştırılması

Abstract

6.0ZET S.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji ve Embriyoloji (VET) Anabilim Dalı DOKTORA TEZİ/KONYA-2001 Emrah SUR Danışman Prof. Dr. İlhami ÇELİK Yumurtaya verilen aflatoksin Bı'in tavukların lenfoid organlarının embriyonal gelişimi üzerindeki etkilerinin enzim histokimyasal yöntemlerle araştırılması Bu çalışmada, yumurtaya verilen aflatoksin Bı (AFBı)'in embriyotoksik etkileri ile kanatlı lenfoid organları üzerindeki etkilerinin histolojik ve enzim histokimyasal yöntemler yardımıyla belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada yumurtacı ırkı tavuklara ait toplam 651 adet yumurta 7 ayrı gruba ayrıldı. Bu gruplardan ilk ikisi kontrol gruplarını (Kontrol-I ve kontrol-2) oluştururken, çözücü olarak kullanılan %30'luk etil alkol (%30 ETOH) grubu dışında 4 farklı AFB] doz grubu oluşturuldu (5 ng, 10 ng, 20 ng ve 40 ng AFBı grupları). Test solüsyonları inkübasyon öncesinde hava kamarası yoluyla yumurtalara enjekte edildiler. İnkübasyonun 7, 10, 12, 13, 15 ve 18. günlerinde açılan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişme evreleri Hamburger-Hamilton skalasına göre belirlendi. Ölü embriyolar evrelerine göre sınıflandırılarak; embriyonik ölümlerin dağılımları belirlendi ve elde edilen sayısal veriler istatistiksel yöntemlerle analiz edildi. Grupların mortal iteleri arasındaki farkların önemli (p<0,05) olduğu tespit edildi. Her döneme ait embriyolardan ve civcivlerden kuluçkadan çıkış dönemi ile takip eden 4.haftada kan örnekleri ile timus, bursa Fabricii ve dalak dokusu örnekleri alınarak 65gerek histolojik yapının belirlenmesi gerekse de enzim histokimyasal yöntemler için uygun yöntemlerle işlenerek hazırlanan preparatlar ışık mikroskobuyla incelendi. AFBı'in embriyotoksisitesinin, dozdaki artışa paralel olarak arttığı; erken embriyonik ölümlerin çoğunlukla yüksek doz gruplarında ve erken embriyonal gelişme evrelerinde yoğunlaştığı tespit edildi. Ayrıca yine yüksek doz gruplarındaki çoğu yumurtada embriyonal disk sahasında aşırı ve düzensiz üreyen area opaca hücrelerinin periferden area pellucida'yı sıkıştırarak fitıklaştırmasıyla belirgin olan anormal gelişme tespit edildi. Histolojik kesitlerde özellikle 10, 20 ve 40 ng AFBı gruplarından elde edilen embriyoların timus, bursa Fabricii ve dalaklarında gelişmenin baskılandığı ve bu organların, kontrollerdeki organlardan daha küçük oldukları dikkati çekti. Kuluçkadan çıkışın ilk gününde timus normal gelişimini tamamlamış olduğu halde, 5 ve 10 ng AFBi gruplarından elde edilen civcivlerde bursa Fabricii ve dalağın gelişiminin tamamlanmamış olduğu gözlendi. Kuluçkadan çıkışı takip eden dördüncü hafta sonunda ise bu iki organın da normal histolojik yapıyı kazanmış oldukları saptandı. Enzim histokimyasal çalışmalar sonucunda perifer kan lenfositlerinde 12. günde ilk olarak ortaya çıkan enzim asit fosfataz (ACP-az) olduğu; bunu 1 3. günde beta-glukuronidaz (BG-az) ve son olarak da 18, günde ortaya çıkan alfa-naftil asetat esteraz (ANAE)'m izlediği tespit edildi. Kuluçkanın 13. gününde perifer kan lenfositlerinde ortaya çıkan BG- az, ilerleyen dönemlerde gözlenmedi. Embriyonal dönemde ACP-az pozitif lenfosit oranlarının 10, 20 ve 40 ng AFBı gruplarında belirgin şekilde kontrol gruplarınınkilerden daha düşük olduğu dikkati çekti. Kuluçkadan çıkışın ilk günü grupların ACP-az pozitif lenfosit oranlan arasındaki farkların önemsiz (p>0,05) olduğu, buna karşın lenfosit oranları ile ANAE pozitif lenfositlerin oranlarının 5 ve 10 ng AFBı gruplarından çıkan civcivlerde önemli oranda (p<0,05) daha düşük olduğu tespit edildi. Ancak kuluçkadan çıkışı takip eden 4.hafta sonunda lenfosit oranlan ile gerek ACP-az pozitif lenfosit oranları ve gerekse de ANAE 66pozitif lenfosit oranları açısından kontrol ve deney grupları arasındaki farkın önemsiz (p>0,05) olduğu görüldü. 67

7.SUMMARY Enzyme histochemical investigations on the effects of aflatosin Bi, administrated in ovo, on the embryonic development of chicken lymphoid organs. In this study, embryotoxicity and detrimental effects of afiatoxin Bı(AFBı) on the embryonic development of chicken lymphoid organs were determined by enzyme histochemical and histological methods. For this purpose, 651 laying hen's eggs were used. The eggs were divided into 7 groups. Two of them were used as a controls (control-1 and control-2). Except for the solvent (%30 ethanol, ETOH) group, 4 different AFBi dose groups were designed (5 ng, 10 ng, 20 ng and 40 ng AFBi). Test solutions were injected via the air-sac at pre incubation period. Eggs from each group were opened at 7th, 10th, 12th, 13th, 15th and 18th days of the incubation. Embryonic stages were determined according to the Hamburger- Hamilton scale. Dead embryos of each group were determined and embryonic morthality values were calculated. Data was analysed by using statistical methods. The differences between morthality values of the controls and the experimental groups were found to be statistically significant. The blood and tissue samples from the thymus, bursa of Fabricius and the spleen were taken from the embryos of each group at different incubation periods, at the end of the incubation and by the fourth week after hatching. Tissue samples were processed for enzyme histochemical methods in adition to routine histological techniques. The effects of AFB] on both enzymatic profile of peripheral blood lymphocytes and embryonic development of lymphoid organs were investigated by light microscope. It was conlcuded that the embryotoxic effects of AFBi to be dose-dependent and early embryonic deaths were particularly increased at high- AFBi doses. On the other hand, especially in 20 and 40 ng AFBi groups, embryonic disc abnormality which characterized with area opaca cells those irregularly proliferated around the area pellcida was observed. Area pellucida protruded out of the embryonal disc because of the copression caused by area opaca cells. 68In histological sections, particularly taken from 10, 20 and 40 ng AFBi groups, the embryonic development of thymus, bursa of Fabricius and spleen were dramatically impaired and the anlages of those organs underdeveloped when compared to those of controls. On the hatching day, development of the thymus was complate while in 5 and 1 0 ng AFBi groups, the development of spleen and bursa of Fabricius were incomplete. At the end of the fourth week after hatching, bursa of Fabricius and spleen were completely developed. Enzyme histochemical demonstrations were carried out in all tissue samples. The first observed enzyme in the blood cells with lymphcyte morphology was acid phosphatase (ACP-ase) which appeared on the 12th day of incubation period, the second was beta- glucuronidase (BG-ase) which appeared on the 13th day of incubation period and the last observed was alpha naphthyl acetate esterase (ANAE) which appeared on the 18th day of incubation period. However, BG-ase disappeared in those cells at the later stages of the incubation. During embryonal period, significant declines were observed in ACP-ase positive lymphocytes rates in 10, 20 and 40 ng AFBj groups. On the hatching day, ACP-ase positive lymphocyte proportions were not different while ANAE positive lymphocyte counts were significantly decreased in 5 and 10 ng AFBj groups. By the forth week after hatching, there was no difference in peripheral blood ACP-az positive, ANAE positive lymphocyte proportions and lymphocyte proportions. Besides there was no difference in histology of lymphoid organs between controls and experimentals. 69