Kedi ve köpeklerde Helicobacter pylori`nin dot-immunobinding assay ve polimeraz zincir reaksiyonu ile teşhisi

Abstract

6. ÖZET S. Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji (VET) Anabilim Dalı DOKTORA TEZİ/ KONYA-2004 Dilek ÖZTÜRK Kedi ve Köpeklerde H. pylori'nin Dot-Immımobinding Assay (DIA) ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) İle Teşhisi Helicobacter türleri, insan ve çeşitli hayvanların sindirim sistemine yerleşen spiral şekilli mikroorganizmalar olup, insan ve hayvanlarda varlığı uzun zamandır bilinmektedir. H pylori, insanlarda gastritis, peptik ülser ve mide adenokarsinomalanmn bir nedeni olarak gösterilmektedir. Bu çalışmada, kedi ve köpeklerin mide mukozalarından endoskopla biyopsi örnekleri alındı ve H pylori, kültür, mikroskopi (fırça sitoloji), üreaz test, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ve Dot-İmmunobinding Assay (DIA) ile araştırıldı. Klinik olarak sağlıklı 50 köpek ve 2 kedi bu çalışmada kullanıldı. Köpek ve kedi midelerinin antrum, korpus ve kardia bölgelerinden 3 'er biyopsi örneği alındı. DIA testinde kullanılmak üzere köpek kan serum örnekleri alındı. Kedi ve köpeklerde H pylori ve diğer Helicobacter türleri izole edilemedi. îzole edilemeyen ancak mikroskopide görülen spiral, gram negatif mikroorganizmalar `Gastrik Helicobacter Benzeri Mikroorganizmalar` olarak isimlendirildi. Kedi ve köpeklerden alınan 154 mide mukoza örneğinin 59'u, Direk üreaz testi ile Helikobakterler yönünden pozitif bulundu. Üreaz testi ile antral örneklerin 26'sında (% 44), korpus ömeüerinin 19'unda (% 32) ve kardia örneklerinin 14'ünde (% 24) gastrik mikroorganizmalar pozitif bulundu. Köpeklerden alman 39 serum örneği DIA ile test edildi ve tüm serum örnekleri, Helicobacter pozitif olarak tespit edildi. 148 köpek ve 6 kedi mide mukoza örneği CAM- 2(5'-TAA CAA ACC GAT AAT GGC GC-3') ve CAM-4 (5'-CAT CTT GTT AGA GGG 49GTT AGA GGG ATT GG-3') primerleri kullanılarak, PZR'a tâbi tutuldu. Bir köpeğin korpusunda H. pylori pozitif tesbit edildi. Sonuç olarak; Bu çalışma ile, kedi ve köpeklerde gastrik helikobakterlerin kültürünün zor ve özel ihtiyaçları nedeniyle genellikle başarısızlıkla sonuçlandığı doğrulandı. Kültür, insanlarda gastrik Helicobacter türlerinin teşhisi için `gold standart` olmasına rağmen, kedi ve köpeklerde izolasyon zordur. Bu nedenle direk üreaz test ve direk mikroskopi (fırça sitoloji) ön tam amacıyla yapılmalıdır. DIA testi ile % 100 pozitiflik, homolog antijenler ve çapraz reaksiyonlar nedeniyle yanlış pozitiflik olarak değerlendirilmiş olup, H. pylorVys spesifik antijenik yapıların ortaya konulması ile bu sorun ortadan kaldırılabilir. Çalışmada, PZR ile köpeklerde H. pylori varlığı tesbit edilmiştir. Yeni çalışmaların klinik olarak da hasta olan kedi ve köpeklerden alınacak biyopsi örnekleri ile farklı primerler kullanılarak yapılmasına ve zoonoz ihtimalinin araştırılmasına yönelmesi önerilebilir. 50

7. SUMMARY Detection of H. pylori by Dot-Immunobinding Assay (DIA) and Polymerase Chain Reaction (PCR) in Cats and Dogs Species belong to Helicobacter genus which are spiral shaped microorganisms and colonised in the alimentary tract of human and several animal species have been known for a long time. H pylori is shown as a causative agent for gastritis, peptic ulcer and gastric adenocarcinoma in human. Biopsy samples from gastric mucosas of cats and dogs were taken by endoscopy in this study. The presence of H. pylori in the samples was investigated by culture, microscopy (brush cytology), direct urease test, PCR and DIA. A number of 50 dogs and two cats which were clinically healthy was employed in the study. Three each of biopsy samples from gastric regions of antrum, corpus and cardia of the cats and dogs were taken. Serum samples from the dogs were also obtained to examine using for the DIA test. Neither H. pylori nor any other Helicobacter spp. could be isolated from the animals used in the study. Gram negative microorganism which have not been able to be isolated although detection by other metods was achieved were called `Gastric Helicobacter-Like - Microorganism`. In 59 out of 154 gastric mucosa samples, positivity for Gastric Helicobacter-Like - Microorganism by the direct urease test were found in 26 (44 %) of samples from antrum, 19 (32 %) from corpus and 14 (24 %) from cardia. Sera from the dogs (n=39) were tested by DIA and all found to be positive. Mucosa samples of the dogs (n=148) and cats (n=6) were analysed using CAM-2 and CAM-4 primers by PCR and produced only one positive result from a dog's corpus. Consequently, culturing Helicobacter species from the gastric biopsy materials obtained from dogs and cats was verified to be difficult and be frequently resulted in failure since some spesific requirements in culturing were necessary. Although culturing is referred as `gold standard` in diagnosis of human-originated Helicobacter species; it 51should not be the case for the trials concerning cats and dogs. Therefore, it is concluded that the direct urease test and the microscopy (brush cytology) together is currently the only way to pre diagnose the Helicobacter in the mucosa of the cats and dogs. Future work can be focused on investigating the presence of Helicobacters in biopsy samples from clinicaly sick cats and dogs by PCR using different primers and examining possible zoonotic nature of the infection. 52