Timokinonun meme kanseri hücrelerinin mirna düzeylerine etkisi

Abstract

Nigella Sativa (Çörek otu)'nın en önemli biyoaktif bileşeni olan timokinon (C10H10O2; 2–izopropil-5-metil-1,4–benzokinon), hücre kültürü ve deneysel hayvan çalışmaları temelli antikanser özellikleri sergiler. Ancak, bu etkilerinin moleküler etki mekanizmaları net değildir. Bu çalışma, MCF7 insan meme kanseri hücresi miRNA'ları profilleri üzerine TQ uygulamasının etkilerini incelemektedirÇalışmamızda, MCF-7 hücreleri timokinonun farklı dozları (5,25,50 uM) ile 70. saatte muamele edildi. Daha sonra total RNA, Roche yüksek saf miRNA İzolasyon Kiti (Roche Diagnostics) kullanarak izole edildi ve hücre lizatlarından cDNA sentezlendi. Gerçek zamanlı qPCR için 84 adet miRNA ekspresyonu, BioMarkTM 96,96 Dynamic Array (Fluidigm Corporation) ile saptanmıştır. İstatistiksel analiz Biogazelle en qase Plus 2,0 yazılımı kullanılarak yapıldı. Göreceli gen ekspresyonu değerlerinin tayini 2-ΔΔCt yöntemi (numunenin normalize edilmiş Ct (eşik döngüsü ) değeri- kontrolün normalize edilmiş Ct değeri) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda, kontrol grubuna kıyasla 84 miRNA'nın 12 tanesi farklı şekilde (fold regulation <2, fold regulation>2, p<0.05) eksprese edilmiştir. Kontrol grubuna kıyasla TQ uygulanan gruptaki miRNA'lardan 10 tanesi downregule (hsa-miR-1, let 7c-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-mir-202-3p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-98-5p) ve 2 tanesinin upregule (hsa-miR-22-3p, hsa-miR-132-3p) olduğu saptanmıştır.Özelleştirilmiş veri tabanları kullanarak hesaplanan analizlere göre (DIANA miRPath v.2.0), PI3 kinaz/AKT (hsa04151), Wnt (hsa04310), MAPK (hsa04010) ve p53 (hsa 04115) sinyal yollakları (KEGG yolak numarası) bu miRNA grubunun temel hedefleri olduğu gibi görünmektedir. Bu bulgular, MCF-7 hücrelerinin miRNA profillerine TQ'nun etkilerini vurgulamaktadır ve daha ileri çalışmalara yardımcı olabilir.

Thymoquinone (TQ), which is the most bioactive component of Nigella sativa (Black cumin),exhibits anticancer characteristics based on cell culture and experimental animal studies. However, molecular action mechanisms of these effects are not clear. This study investigates the effects of TQ treatment on MCF7 human breast cancer cell miRNAs profiles.In our study, MCF7 cells were treated with different doses of TQ (5, 25, 50 μM) for 70 hours. Then total RNA was isolated by using Roche High Pure miRNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) and cDNA was synthesized from cell lysates. The expressions of 84 miRNAs were determined by The BioMarkTM 96.96 Dynamic Array (Fluidigm Corporation) for real-time qPCR. Statistical analysis was performed using the Biogazelle's qbase PLUS 2.0 software. Determinations of relative gene expression values were carried out by using the 2-∆∆Ct method (normalized threshold cycle (Ct) value of sample minus normalized Ct value of control).As a result of the statistically analysis, twelve of 84 miRNAs have been differentially expressed compared to control group (fold regulation <2, fold regulation>2, p<0.05). It was established that 10 miRNAs were down-regulated (hsa-miR-1, let 7c-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-mir-202-3p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-98-5p) and 2 miRNAs were up-regulated (hsa-miR-22-3p, hsa-miR-132-3p) in TQ's groups, comparing with control group. According to computational analyses using specialized databases (as DIANA miRPath v.2.0); PI3 kinase/AKT (hsa04151), Wnt (hsa04310), MAPK (hsa04010) and p53 (hsa 04115) signaling pathways (KEGG pathway number) seem to be the key targets of these miRNA group. Thesefindings highlight the effects of TQ to miRNA profiling of MCF7 cells and may be helpful for further studies.