Nefelometrik alfa-1-antitripsin metodu kurulması ve performans özellikleri

Abstract

7. ÖZET NEFELOMETRİK ALFA-1-ANTİTRİPSÎN METODU KURULMASI VE PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Alfa-1-antiripsin (aı-AT) insan serumunda ana proteaz inhibitörüdür ve inflamatuar reaksiyonlar esnasında potansiyel olarak salman zararlı enzimlerden dokuları korumada önemli bir role sahiptir. Bu reaksiyonlarda lökosit elastaz gibi proteolitik enzimler salınırlar ve inflamasyon bölgesinde lokal olarak inaktive edilirler. Plazma aıAT seviyeleri aı-AT eksikliğine ve çeşitli sekonder hastalıklara bağlı olarak değişmektedir. aı-AT plazma konsantrasyonları fonksiyonel ya da immünokimyasal metotlarla ölçülebilir. Fonksiyonel metotlar tripsin ya da elastazm inhibisyonu esasına dayanır. İmmünokimyasal metotlar olarak da radyal immundifüzyon, elektroimmunoassay ve otomatize nefelometrik metotlar kullanılmaktadır. İmmünolojik metot sonuçlan sıklıkla ticari standartlardaki farklılıklardan dolayı laboratuarlar arasında değişmektedir. Hastanemize çeşitli hastalıklardan dolayı başvuran hastaların klinik açıdan en iyi bir şekilde değerlendirilebilmesi için aı-AT tayininde seçkin bir yeri olan nefelometrik metot en iyi bir şekilde kurulmaya çalışıldı, metodun hassas, spesifik, tekrarlanabilir ve aynı zamanda da hızlı olması gibi arzu edilen durumlar göz önünde bulundurulmasının yanı sıra aıAT tayininde laboratuarımızın kendi kendine yeterli olabileceği ortaya konmuştur. Bu çalışmada, insan aı-AT ile albino tavşan immunize edilerek, insan aıAT'sine spesifik poliklonal antikor oluşumu sağlandı. Elde edilen antiserum amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değiştirme kromotografisi işlemlerine tabi tutuldu. Saflaştırma sonucu elde edilen antiserumlar ile nefelometrik tayin metotları kuruldu. İnsan aıAT'sine spesifik olarak oluşturulan antikorlar ile nefelometrik aıAT metodu kurularak, metodun performans özellikleri (hassasiyeti, tekrarlanabilirliği, spesifıkliği ve hızlılığı) ortaya koyuldu. Ayrıca metot hazır ticari IgG'leri saflaştınlmış antikor ile ve halen kullanılan metot ile de karşılaştırıldı. Yaptığımız çalışmada ticari nefelometrik metot, iyon-değiştirme kromatografısi sonucu elde edilen antiserumla kurulan metot ve ticari IgG'leri saflaştınlmış antiserumla kurulan metodun performans118 karakteristikleri sırasıyla within run çalışmada %CV'leri 2.46, 2.82 ve 1.00 olarak between run çalışmada ise 3,58, 3,17 ve 1.07 olarak bulundu. Ayrıca regresyon katsayıları sırasıyla ilk iki metot için r = 0,939, 1. ve 3. metot için r = 0,977, 2. ve 3. metot için de r = 0,965 olarak bulundu. Kalıtsal oiı-AT eksikliği bulunan ailede her üç metot ile yapılan ölçümlerde; PI ZZ, PI MZ varyantlarına sahip hastalarda otı-AT serum seviyeleri sırasıyla ortalamaları (X) ve standart sapmaları (SV) normalin % 24.36 ± 3.59 ve % 64.8 ± 6.72 olarak bulundu. Yaptığımız çalışmadaki sonuçlara göre her üç metot birbiri yerine kullanılabilir ve ayrıca laboratuarımız tarafından aı-AT'nin tayininde kullanılan poliklonal antikorun üretimi sağlanmış olmasının yanı sıra, diğer spesifik proteinlerle ilgili çalışmalara öncülük etmesi bakımından da önem taşımaktadır. Anahtar Kelimeler: Alfa-1-antitripsin, immünokimyasal metot, nefelometre, kalıtsal (Xı-AT eksikliği

8. SUMMARY DEVELOPMENT OF NEPHELOMETRIC arAT METHOD AND ITS PERFORMANCE CHARACTERISTICS Alpha- 1 -antitrypsin (ai-AT) is the major protease inhibitor in human serum, and plays an important role protecting tissue from potentially harmful enzymes released during inflammatory reaction. Proteolytic enzymes such as leukocyte elastase are usually released and inactivated locally at the site of inflammation. Plasma concentrations of ai-AT alter in associated with otiAT deficiency and secondary diseases. The concentrations of ai-AT in plasma can be measured either by functional assays or by immunochemical methods. Functional assays, which evaluate inhibition of trypsin or elastase. Immunologic methods include radial immunodiffusion, electroimmunoassay and automated nephelometric methods. The results of immunologic methods frequently vary considerably between laboratories because of the differences in commercial standards supplied. In this study, rabbits were immunized with purified human ocı-AT and provided the production of polyclonal antiserum. IgG antibodies from antiserum were purified by ammonium sulphate precipitation and then by ion-exchange chromatography. A nephelometric method was developed with the purified IgG antibodies. The methods developed with commercial antiserum (1st method), with antibodies produced in our laboratory (2nd method) and a purified commercial polyclonal antibodies (3rd method) were compared with each other and their performance characteristics were determined. The performance characteristics of the three methods were found as 2,46, 2,82 and 1,00 (CV%) by within run studies and as 3,58, 3,17 and 1,07(CV%) by between run studies, respectively. The correlation coefficients (r) were found to be 0,939 for the first and second methods, 0,977 for the first and third methods, and 0,965 for the second and third methods. Concentrations of (Xi-AT in a family (individuals having PI ZZ and PI MZ variants of the enzyme) with ai-AT deficiency were measured by each method and plasma concentrations120 of these two variants were found 24.36% ± 3.59 and 64.8 %± 6.72 of the normal PI MM level, respectively. After performing statistical analyses, it was concluded that the methods evaluated in the study were consistent with each other. In addition, the present study may be a guide for subsequent researches for determination of the other specific proteins by nephelometric methods. Key Words: Alpha- 1 -antitrypsin, immunochemical methods, nephelometry, oci-AT deficiency