Saflaştırılmış farklı orijinli karbonik anhidraz enzimleri üzerine in vitro peroksinitrit muamelesinin etkilerinin incelenmesi

Abstract

7. ÖZET Oksidan bir ajan olan peroksinitritin karbonik anhidrazın esteraz aktivitesi üzerine ve proteinlerin elektroforetik hareketliliklerine olan etkilerini incelemek amacıyla yapılan bu çalışmada insan eritrositlerinden izole edilen ve saflaştırılan karbonik anhidraz I ve karbonik anhidraz II izoenzimleri (hCA I ve hCA II), sığır eritrosit karbonik anhidrazı (BCA) ve sığır serum albumini (BSA) kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan peroksinitrit, asidik çözeltideki hidrojen peroksidin sodyum nitrit ile muamele edilmesiyle oluşan kararsız peroksinitröz asidin sodyum hidroksit kullanılarak kararlı peroksinitrit anyonuna dönüştürülmesi sonucu elde edilmiştir. Sentezlenen peroksinitritin sıcaklık ve pH'ya bağlı kararlılığını belirlemek için yapılan denemeler neticesinde molekülün -70 °C ve bazik pH'da uzun süreler saklanabileceği tespit edilmiştir. Enzimlerle muamele denemeleri sırasında da buz banyosunda ve bazik pH'da bekletildiğinde peroksinitrit konsantrasyonunda önemli bir değişiklik olmadığı görülmüştür. Peroksinitrit - karbonik anhidraz etkileşiminin gerçekleştirildiği denemelerde peroksinitrit bozunma ürünlerinin artan konsantrasyonunun enzimin esteraz aktivitesini artırdığı, ancak peroksinitritin bu artmış aktiviteyi azalttığı gözlendi. Peroksinitrit konsantrasyonundaki artış beraberinde aktivitenin daha fazla azalışını getirmiştir. Peroksinitrit bozunma ürünlerinin konsantrasyonundaki artışla birlikte aktivite de lineer olarak artmıştır. Peroksinitritin ayrıca karbonik anhidrazm üzerindeki tirozin birimlerini nitroladığı ve bu etkinin enzimin denature ya da doğal yapıda olmasıyla fark etmediği belirlenmiştir. Bunun yanında peroksinitritle muamele neticesinde proteinlerin elektroforetik hareketliliklerinde fark edilebilir bir değişikliğin olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak peroksinitrit karbonik anhidrazı özellikle tirozin birimlerinden modifiye etmekte ve aktivitesini azaltmaktadır.

8. İNGİLİZCE ÖZET (SUMMARY) INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF IN VITRO PEROXYNITRITE TREATMENT OVER ISOLATED CARBONIC ANHYDRASE ENZYMES OF VARIOUS ORIGINS In the current study, which was conducted to determine the effect of peroxynitrite, a highly toxic agent, over carbonic anhydrase enzyme activity, human carbonic anhydrase I and II (hCA I and hCA II), which were isolated from erythrocytes in our laboratory, bovine carbonic anhydrase (BCA), and bovine serum albumin (BSA) were used. The peroxynitrite used in the study was synthesized by mixing acidic hydrogen peroxide solution with sodium nitrite solution and then adding sodium hydroxide solution into the mixture in order to stabilize highly labile compound peroxynitrous acid in the form of peroxynitrite anion. The tests performed in order to determine the best storage conditions for and the stability under different pHs and temperatures of peroxynitrite proved that the synthesized peroxynitrite can be stored for long times, may be more than a year, in basic solutions at -70 °C. In addition, it was also determined that no significant change in concentration occurred while peroxynitrite solutions were being used for enzyme activity tests if the solutions were kept in ice bath or in refrigerator. The study revealed that the decomposition products of peroxynitrite increased the carbonic anhydrase esterase activity, though peroxynitrite itself decreased this elevated activity. As the concentration of peroxynitrite increased more, the enzyme activity dropped still further proving a linear relationship. Similarly, the increase in the concentration of peroxynitrite decomposition products was accompanied by the increase in the activity. The study also showed that peroxynitrite nitrated the tyrosine residues of carbonic anhydrase and this effect was not depended on whether the enzyme was in natural form or in the form denatured by acid and heat treatments. In addition, no observable difference was seen in the electrophoretic mobility of the proteins as a result of peroxynitrite treatment. In conclusion peroxynitrite itself modifies carbonic anhydrase at tyrosine residues and thus decreases its activity.