Lösemi hücre serisinde kafeik asit fenetil ester`in tet2 ekspresyonu ve hücre döngüsü üzerine etkisi

Abstract

Amaç: Akut Myeloid Lösemi (AML) patogenezindeki genetik ve epigenetik değişikliklerin kapsamlı olarak tanımlanmasıyla DNA metilasyonu ve histon metilasyon/asetilasyonu aracılı myeloid öncül hücrelerin çoğalmasında ve farklılaşmasında değişimlerin olduğu saptanmıştır. DNA metilasyonuna yol açan TET2 gen mutasyonlarının varlığında hücre döngüsü bozularak apopitozis inhibe olmaktadır. Bal arıları tarafından toplanan reçineli bir madde olan propolis ve etken maddesi kafeik asit fenetil ester (CAPE), antiinflamatuar, antiviral ve antikanser özellikleri bulunan bir bileşiktir. Bu çalışmada, K562 lösemi hücre serisinde CAPE'in hücre döngüsü ve TET2 gen ekspresyonu üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı.Gereç ve Yöntem: K562 hücre serileri sitozin arabinozid (ARA-C), CAPE ile 37˚C0 de 4 gün inkübe edilerek hücre döngüsü ve TET2 gen ekspresyonu değerlendirildi. TET2 mRNA ekspresyonu delta Ct metoduyla RPL0 ya karşı normalize edilerek hesaplandı. Hücre döngüsü basamakları Cycle TEST Plus DNA Reagent kit ile belirlendi. Hücrelerin DNA miktarları Modfit programında analiz edilip verilerin istatistiksel analizleri Grafpad prism V6 programı ve student's t-test kullanılarak yapıldı. P<0,05 anlamlı kabul edildi. Bulgular: Kontrol grubunda diploid hücrelerin %32.6'sı G1 fazında, %8'i G2 fazında, %59.4'ü S fazında, tetraploid hücre miktarı %5.6 ve hücrelerin %100'ü G1 fazında idi. Buna karşılık CAPE ilave edilen hücrelerde %93.59 oranında diploidi mevcut olup bunların %31.4'ünün G1 fazında, %8'inin G2 fazında olduğu gözlendi. Geri kalan %60.5 hücre ise S fazında saptandı. Kontrol gurubu ile CAPE eklenen hücre serilerinde hücre döngüleri arasında anlamlı fark olmadığı izlendi. 25 nM dozunda ARA-C ilave edilerek hazırlanan hücre kültürü akım sitometrik değerlendirmede diploid hücrelerin oranı %93.5 olup, bunların %31.4'ü G1, %8'i G2 ve %60.5'i S fazındaydı. Tetraploid hücre oranı %6.4 olup, tümünün G1 fazında olduğu izlendi. ARA-C ve 5 µM dozunda CAPE ilave edildiğinde hücrelerin %93.7'sinin diploid olduğu, %32.3'ünün G1 fazında, %8'inin G2 fazında, %59.6'sının S fazında olduğu, tetraploid hücrelerin de %100'ünün G1 fazında olduğu saptandı. ARA-C ile karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktu buna karşılık TET2 gen ekspresyonunun kontrol gurubuna göre CAPE varlığında 2,5 kat artığı izlendi (p<0,001).Sonuç: CAPE'in K562 serilerinde hücre döngüsüne etki etmediği, TET2 gen ekspresyonunu artırması lösemi veya MDS tedavilerine CAPE eklenmesinin TET2 gen ekspresyonu artırıcı etkisiyle katkı sağlayabileceğini düşündürmekle birlikte, bu sonuçların ileri çalışmalarda desteklenmesi gerekmektedir.

Objective: A comprehensive definition of genetic and epigenetic alterations in the pathogenesis of acute myeloid leukemia (AML) has shown that there are changes in the proliferation and differentiation of DNA methylation-mediated and histone methylation- and acetylation-mediated myeloid progenitors. In the presence of TET2 gene mutations that lead to DNA methylation, the cell cycle is disrupted, thereby inhibiting apoptosis. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) is a bioactive component of propolis from honeybee hives and has antiinflammatory, antiviral, and anticarcinogenic properties. This study aimed to investigate the effect of CAPE on the expression of TET2 and the cell cycle in the K562 leukemia cell line.Materials and Methods: The K562 leukemia cells were incubated with cytosine arabinoside (ARA-C) and CAPE at 37˚C0 for 4 days to evaluate the cell cycle and the expression of TET2. TET2 mRNA expression was normalized against RPLP0 gene and calculated using the delta-delta Ct method. The distribution of cells within the different phases of the cell cycle was detected using the Cycletest Plus DNA Reagent Kit. DNA content of cells was analyzed using ModFit software. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism Version 6. Student's t-test was used in the analysis. P < 0.05 was considered significant. Results: In the control group, 32.6% of diploid cells were in the G1 phase, 8% in the G2 phase, and 59.4% in the S phase; the percentage of tetraploid cells was 5.6% and 100% of the cells were in the G1 phase. On the other hand, the percentage of diploid cells was 93.59% in CAPE-added cells; 31.4% of them were in the G1 phase and 8% in the G2 phase. The remaining 60.5% was in the S phase. There was no significant difference between the cell cycles of the control group cells and CAPE-added cells. The flow cytometric analysis of the cell culture treated with 25 nM ara-C showed that the percentage of diploid cells was 93.5% with 31.4% in the G1 phase, 8% in the G2 phase, and 60.5% in the S phase. The percentage of tetraploid cells was 6.4% and all tetraploid cells were in the G1 phase. In the cell culture treated with 5 μM CAPE and ara-C, the percentage of diploid cells was 93.7% with 32.3% in the G1 phase, 8% in the G2 phase, and 59.6% in the S phase. 100% of tetraploid cells were in the G1 phase. No significant difference was found compared to ara-C, while the expression of TET2 increased two and half time in the presence of CAPE compared to the control group (p < 0.001).Conclusion: The study found that CAPE had no effect on the cell cycle in the K562 cell line but increased the expression of TET2. The effect of CAPE on the increased expression of TET2 might aid in the treatment of leukemia or myelodysplastic syndrome. Further research is required to support these results.