Keratinosit farklılaşmasında rol alan reseptörle etkileşen serin treonin kinaz 4 (RIPK4) ve keratin 14 (KRT14) proteinleri arasındaki etkileşimin araştırılması

Abstract

Epidermal farklılaşma dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi sağlayan epidermisin oluşumu için gereklidir. Eksikliği epidermal farklılaşma bozuklukları ile ilişkilendirilmiş RIPK4 proteininin bu süreçteki fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. RIPK4'ün epidermal farklılaşmadaki rolünün belirlenmesine yönelik yapılan çalışmalarımız kapsamında insan keratinosit cDNA kütüphanesi RIPK4'ün yem olarak kullanıldığı büyük ölçek maya ikili hibrit yöntemiyle taranmıştır. Tarama sonucunda epidermal farklılaşmada kritik bir öneme sahip olan RIPK4'ün epidermisin bazal tabaka markörü olan KRT14 proteini ile etkileştiği ön verisine ulaşılmıştır. Bu ön veri bu iki proteinin bu süreçte hücresel bir fonksiyonu yerine getirmek için bir araya gelebileceği hipotezini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışma ile amaçlanan maya ikili hibrit sonucunda elde edilen RIPK4-KRT14 etkileşiminin immünopresipitasyon, immünofloresan ve in vitro pull down yöntemleri kullanılarak doğrulanması ve detaylı olarak analiz edilmesidir. İmmünopresipitasyon deney sonuçlarımız, RIPK4'ün KRT14 ile etkileştiğini doğrulamakla birlikte, bu etkileşimin RIPK4'ün N terminalinde bulunan kinaz domaini üzerinden gerçekleştiğini gösterdi. RIPK4'ün KRT14 ile sitoplazmada ve belirgin olarak çekirdeği saran yapıda birlikte yerleştiğini ortaya çıkaran immünoflorasan deney sonuçlarımız ise iki protein arasında tanımladığımız etkileşimi destekler nitelikteydi. Bunun yanında, bakteride ürettirilen RIPK4 ve KRT14 proteinlerini kullanarak gerçekleştirdiğimiz in vitro pull down analizi, bu iki proteinin aracı bir protein olmadan da etkileştiğini ortaya çıkardı. Sonuçlarımız ile epidermal farklılaşma sürecinin iki önemli proteini RIPK4 ve KRT14'ün etkileştiği ilk kez gösterilmiş oldu.Anahtar Sözcükler: GST pull down, immünofloresan, immünopresipitasyon, KRT14,RIPK4

Epidermal differentiation is required for generation of epidermis that provides a protective barrier against environment. The function of RIPK4 gene, whose deficiency is associated with severe epidermal differentaition related abnormalities, is not fully known yet. Thereby, to investigate the role of RIPK4 in epidermal differentiation, human keratinocyte cDNA library was screened with large scale yeast two hybrid using RIPK4 kinase domain as a bait and it was found that RIPK4 interacted with KRT14 which is a basal layer marker of epidermis. Identified interaction between RIPK4 and KRT14 raised the hypothesis that these two proteins might come together to perform a cellular function during epidermal differentiation process. The aim of this study is to verify and analyse the RIPK4-KRT14 interaction obtained from yeast two hybrid assay by using immunoprecipitation, immunofluorescence and in vitro pull down methods in detail. Our immunoprecipitation assay results showed that RIPK4 interacted with KRT14 and this interaction was mediated by the kinase domain located at the N terminus of RIPK4. The results of immunofluorescence assay, which showed the co-localization of RIPK4 and KRT14 in the cytoplasm particularly on the structure surrounding the nucleus, supported the interaction result identified by immunoprecipitation assay. Additionally, in vitro pull down analysis that was performed by using the RIPK4 and KRT14 proteins produced in bacteria revealed that the interaction between RIPK4 and KRT14 was direct. With our results the interaction between RIPK4 and KRT14, which are the two important proteins of epidermal differentiation, was demonstrated for the first time.Keywords: GST pull down, immunofluorescence, immunoprecipitation, KRT14, RIPK4