Gram negatif bakterilerde disk difüzyon testini kullanarak olası direnç mekanizmalarının saptanması

Abstract

IV.OZET Hastanelerde dirençli mikroorganizmaların yol açtığı infeksiyonlar giderek daha büyüyen bir sorun haline gelmektedir. Bu nedenle gerek toplumda gerekse hastane ortamında antibiyotiklere direnç mekanizmalarını ve bu mekanizmaların hangi mikroorganizmada hangi sıklıkta bulunduğunu ortaya koymak antibiyotiklere direnç gelişimini önlemede önemli bir adım olacaktır. Mikroorganizmalarda, antibiyotiklere direnci kesin olarak ortaya koymak ancak moleküler yöntemlerle mümkün olmaktadır. Bununla birlikte moleküler yöntemler hem uzun zaman alan hem de oldukça pahalı yöntemlerdir. Disk difüzyon yöntemi gibi uygulanması kolay, ucuz ve kısa sürede sonuç veren bir yöntem ile antibiyogramın yorumlanarak okunması antibiyotiklere direnç mekanizmalarını ortaya koymada önemli ipuçları verebilmektedir. Antibiyogramın yorumlanmasından amaç; duyarlılık deneyleri sonuçlarının bakteri identifikasyonu, bakterilerdeki antibiyotik direnci sıklığı konusundaki istatistiksel bilgiler, bakterilerdeki direnç mekanizmaları ve bu mekanizmalardan etkilenen antibiyotikler dikkate alınarak, hatalı sonuçlardan kaçınmak ve olabildiğince doğru bir sonuca ulaşmaktır. Bu çalışmada, hastanemizde sık izole edilen Gram negatif bakterilerde sadece antibiyotik duyarlılık testlerini kullanarak muhtemel direnç mekanizmalarım ve sıklığım belirlemeyi, dirence bağlı olarak antibiyogram yorumlamayı ve hasta için en uygun antibiyotik seçiminde klinisyene yardımcı olmayı, böylece direnç gelişimini engellemeyi amaçladık. Çalışma kapsamına 100 Klebsiella türü, 100 Escherichia coli, 30 Enterobakter türü ve 100 Pseudomonas aeruginosa izolatı alındı. E. coli, Klebsiella ve Enterobakter türlerinde ampisilin, amoksisilin/klavulanik asit, piperasilin, piperasilin/tazobaktam, tikarsilin, tikarsilin/klavulanik asit, sefalotin, seftazidim, sefuroksim, sefoksitin, sefotaksim, sefepim, aztreonam ve imipenem diskleri, P. aeruginosa'da ise, piperasilin, piperasilin/tazobaktam, tikarsilin, tikarsilin/klavulanik asit, seftazidim, sefepim, aztreonam, imipenem, meropenem, kolistin ve siprofloksasin diskleri ile disk difüzyon testi yapılarak, antibiyogramdan olası direnç mekanizmaları belirlenmeye çalışıldı. Çalışmamızda K. pneumoniae ve K. oxytoca izolatlanmn sırasıyla % 17.6 ve % 13.4'ünde klasik veya düşük SHV-1/K1, K. pneumoniae izolatlanmn % 1.2'sinde yüksek penisilinaz, K. pneumoniae ve K. oxytoca izolatlarının sırasıyla % 74.1 ve % 53.3 'ünde genişlemiş spektrumm jS-laktamaz (GSBL) ve K. oxytoca izolatlanmn % 33.3'ünde Kİ enziminin yüksek miktarda üretimi bulunmuştur. VIE. coli izolatlarmın % 3 Tinde klasik, % 16'sında düşük penisilinaz, % 14'ünde yüksek penisilinaz ve % 39'unda GSBL üretimi saptanmıştır. Enterobakter izolatlarmın % 63.4'ünde klasik indüklenebilir Amp C, % 6.6'smda penisilinaz, % 3.3'ünde GSBL, % 23.4'ünde dereprese Amp C üretimi bulunmuştur. Bir Enterobakter izolatındaki direnç mekanizması fenotipik olarak yorumlanamamıştır. P. aeruginosa izolatlarmın % 27'sinde klasik, % 14'ünde penisilinaz, % 7'sinde dereprese Amp C, % 36'smda dereprese Amp C ile Opr D porin kaybı direnç mekanizmalanmn birlikteliği, dereprese Amp C ile birlikte bir metallo /3-laktamaz varlığı, dereprese Amp C ile GES-2 gibi GSBL özelliği taşıyan bir enzimin varlığı ya da yalnız başına dereprese Amp C enziminin aşırı üretimi olabileceği şeklinde yorumlanmıştır. P. aeruginosa izolatlarmın % 5'inde Opr D porin kaybı ile yüksek seviyeli penisilinaz, % 6'sında efluks ve % 5'inde de çoğul direnç mekanizmalanmn varlığı düşünülmüştür. Sonuç olarak, yorumlayıcı okumayla fenotipik özelliklerden yola çıkılarak direncin muhtemel biyokimyasal mekanizmaları anlaşılabilir. Tedavi açısından risk oluşturan antibiyotik-mikroorganizma kombinasyonlarına klinisyenin dikkati çekilebilir. Yorumlayıcı okuma daha iyi bir tedavi sağlamakla kalmaz aynı zamanda düşük seviyeli direncin tesbiti ve klinikte kullanılan antibiyotiklerin daha uzun ömürlü olmasına katkıda bulunur. Tesbit edilen mekanizmadan direnç fenotipinin önceden belirlenmesine olanak sağlar. Yorumlayıcı okuma, son zamanlarda tanısal mikrobiyolojide oldukça önem kazanmakla beraber, direnç mekanizmalanmn ortaya konmasında genetik ve biyokimyasal yöntemlerin yerine geçemez. Yorumlayıcı okumada bazı güçlükler çekilmektedir. En önemlisi, aynı grup antibiyotikleri etkileyen pek çok direnç mekanizması vardır ve bunlann sıklığı giderek artmaktadır. Yorumlayıcı okuma yem direnç mekanizmalarım tam olarak ortaya koyamabilir, çünkü sonuçlar, bilinen direnç fenotiplerine göre yorumlanır. Aynca az veya çok miktarda enzim sentezleyen izolatlann özellikle inhibitörlere karşı değişken sonuç vermeleri ve bazı suşlarda birden fazla direnç mekanizmasının bir arada bulunması bu yöntemdeki sınırlamalardır. V. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Gram negatif bakteriler, Yorumlayıcı okuma, Direnç mekanizmalan, 3-laktamazlar vn

VI. ABSTRACT Infections due to resistant microorganisms at hospitals have recently and more importantly posed an increasing problem. Bearing this fact in mind, determining the frequency of availability of mechanisms having resistance to antibiotics should be a major step in terms of preventing any build-up resistance to antibiotics either in or out of hospital. Molecular methods are the only methods by which microorganism's resistance mechanism to antibiotics can be detected. However, molecular methods are quite expensive and time consuming. Interpretative reading of antibiograms with the help of disk diffusion method, which is more practical, cheap and efficient in short time, can provide important hints about the mechanism of resistance to antibiotics. The aim of interpretative reading of the in vitro antibiotic susceptibility testing is to get sound results as much possible as through considering bacterial identification, results of susceptibility tests, statistical data on the frequency of antibiotic resistance in bacteria, resistance mechanisms in bacteria and antibiotics affected by those mechanisms. In this study, our aim is to determine the possible resistance mechanisms and their frequency, to interpret antibiograms depending on resistance, and to help physician choose the most suitable antibiotics for the patients by using only antibiotic susceptibility tests on gram negative bacteria isolated in our hospital. By doing so, preventing resistance development is targeted. This study covers 100 Klebsiella spp., 100 Escherichia coli, 30 Enterobacter spp. and 100 Pseudomonas aeruginosa isolates. It has been tried to determine possible resistance mechanisms in antibiograms with the help of disk diffusion tests conducted with the disks of ampicillin, amoxicillin clavulanic acid, piperacillin, piperacillin tazobactam, ticarcillin, ticarcillin clavulanic acid, cefhalotin, ceftazidime, cefuroxime, cefoxitin, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem, in E coli, Klebsiella spp. and Enterobacter spp., and the disks of piperacillin, piperacillin tazobactam, ticarcillin, ticarcillin clavulanic acid, ceftazidime, cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem colistin and ciprofloxacin in P. aeruginosa. In our study, K. pneumoniae and K. oxytoca isolates produced classical (17.6%) and low SHV-1/K1 (13.4%) respectively. 1.2% of K. pneumoniae isolates produced penicillinase- high, 74.1% of K.pneumoniae and 53.3% of K. oxytoca isolates produced extended-spectrum beta lactamase (ESBL), and 33.3 % high amount of Kl enzymes. vinProduction of classical (31%), low penicillinase (16%), high penicillinase (14%) and ESBL (39%) were observed in E. coli isolates. Production of classical AmpC inducible (63.4%), penicillinase (6.6%), ESBL (3.3%) derepressed AmpC (23.4%), were observed in enterobacter isolates. Resistance mechanism in an enterobacter isolate could not be interpreted as phenotypic. Production of classical (27%), penicillinase (14%), derepressed AmpC (7%) were found in P. aeruginosa isolates. Additionally, derepressed AmpC at the rate of 36% was considered to be found possibly along with the loss of OprD porin, a metallo-/3 lactamase, GES-2 having ESBL characteristics, or overproduction of derepressed AmpC enzyme could be considered. Availability of derepressed AmpC and high level penicillinase (5%), increased efflux (6%), and of multiple resistance mechanisms in P. aeruginosa isolates was thought. As a result, biochemical mechanisms of resistance can be figured out through interpretative reading taking care of phenotypic characteristics. Physician's attention can be focused on the combination of antibiotic-microorganism mechanisms which involve risky element to treatment. Interpretative reading not only provides a better treatment but enable clinical antibiotics to have a longer life and low level resistance to be determined as well. Resistance phenotypes in the subject mechanism can be pointed out in advance through interpretative reading. Although interpretative reading has a considerable importance in diagnostic microbiology, it cannot be substituted for genetic and biochemical methods to determine resistance mechanisms. Some difficulties have been faced in interpretative reading. The most important one is that there are a lot of resistance mechanisms being effective on the same group of antibiotics, and their frequency is getting overrated. Interpretative reading cannot fully identify new resistance mechanisms because results are interpreted according to known resistance mechanisms. Additionally, variable results of isolates synthesizing more or less enzymes, against inhibitors, and the multiple existence of resistance mechanism in some isolates are the major constraints in interpretative reading. VII. KEY WORDS: Gram negative bacteria, interpretative reading, resistance mechanisms, P-lactamases. IX