Behçet hastalarında serbest nükleik asit düzeyinin real-time PCR metodu ile araştırılması

Abstract

ÖZET Hulusi Behçet tarafından 1937 yılında tariflenen Behçet hastalığı, tekrarlayan oral aft, genital ülserasyonlar, deri ve göz lezyonları, artrit, santral sinir sistemi ve vasküler tutulum ile karakterize multisistemik inflamatuvar bir hastalık olarak tanımlanmıştır. Hastalığın kesin orijini henüz bilinmemektedir. Etyolojide olası sebepler, antijenler arasındaki çapraz reaksiyonlar, streptokokkal ve viral enfeksiyonlara karşı oluşan immün cevap sayılmaktadır. Patognomonik bir laboratuvar testi mevcut değildir ve tanı klinik kriterler ile konur. İlk kez 1948 yılında plazmada tespit edilen serbest nükleik asitler, daha sonraki yıllarda otoimmün hastalıklar, kanser hastaları ve prenatal tanı başta olmak üzere birçok hasta grubunda çalışılmış ve bu hastalarda non-invazif tanı olanaği sağlamıştır. Plazma veya serumda bulunan nükleik asitlerin salınma mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber mononükleozom formunda bulunması apoptozisden orijin alabileceğini düşündürmüştür. Sirkülasyondaki nükleik asitlerin ölçümünde birçok teknik kullanılmış olmasına karşın günümüzde en çok kullanılan metot PCR'ın modifiye şekli olan ve eş zamanlı determinasyon sağlayan kantitatif real-time PCR'dır. Yapılan çalışmalarda romatoid artrit, sistemik lupus eritematozus, sistemik skleroz gibi birçok sistemik otoimmün hastalıkta sirkülasyondaki nükleik asit seviyesi yüksek olarak bulunmuştur. Behçet hastalığı da multisitemik inflamatuvar bir hastalık olarak bilinmektedir. Bu nedenle Behçet hastalığında da sirkülasyondaki nükleik asit miktarı yüksek olarak beklenebilir. Bu yükseklik hastalığın etyopatogenezini anlamada, tanı ve takibinde önemli non-invazif bir belirteç olabilir. Literatürde bu yönde bir çalışma olmaması nedeniyle Behçet hastalarında sirkülasyonda serbest olarak dolaşan nükleik asit miktarının çalışılması uygun görülmüştür. VIIYapılan çalışmaya 2003-2005 yılları arasında, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Dermatoloji ve Göz Hastalıkları Anabilim Dallarına başvuran ve Behçet hastalığı tanısı alan 23 erkek ve 27 kadın toplam 50 hasta (yaş ortalaması 35.28 ± 10.25) dahil edildi. Kontrol grubuna ise 13 erkek ve 16 kadın sağlıklı 29 kişi (yaş ortalaması 36.14 ±9.18) dahil edildi. Hasta ve kontrollerden K3-EDTA'lı tüplere 4.5 mL tam kan alındı. Tam kandan elde edilen plazmada kantitatif real-time PCR metodu ile nükleik asit düzeyi çalışıldı. Üveit bulgusu olmayan Behçet hastaları, üveit bulgusu olan Behçet hastaları ve kontrol grubu birbirleriyle karşılaştırıldı. Aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı tespit edildi. Yine yapılan istatistiksel değerlendirmede gruplar arasında hastalık aktivitesi, hastalık süresi ve cinsiyet açısından anlamlı bir ilişki bulunamadı. Elde edilen sonuçlar plazmadaki serbest nükleik asitlerin yarılanma ömürlerinin çok kısa olması ile açıklanabilir. Bu durumda Behçet hastalannda serbest nükleik asit düzeylerinin yanında DNA hasarının araştırılması daha doğru bir yaklaşım olabilir. Yine Behçet hastalannda olası DNA hasarında ve DNA'nın ekstrasellüler alana çıkmasında etkili olduğu düşünülen apoptozisin tespit edilmesi için apoptotik genlerin ekspresyonlannm incelenmesi de önerilebilir. Plazma ve serumdaki nükleik asitler konusunda yapılan bu çalışmalar yeni araştırma alanlarının ortaya çıkmasına yol açmış ve moleküler tanıda yeni imkanlar sağlamıştır. Son 1 5-20 yıllık sure içinde sirkülasyondaki DNA uygulamalarına olan ilgi hızla artmıştır. Bu alandaki gelişmeler; kanser, otoimmun hastalıklar, prenatal tanı, transplantasyon ve travma hastalan başta olmak üzere çeşitli hastalıklann non-invazif tanı ve takibini mümkün kılması sebebiyle önemlidir. Anahtar Sözcükler: Behçet hastalığı, real-time PCR, serbest nükleik asit VIII

SUMMARY Behçet's disease described in 1937 by Hulusi Behçet is defined as a multisystemic inflamatory disease which characterized with recurrent oral aphthea, genital ulcerations, skin and eye lesions, arthritis, central nerve systenı and vascular components. The certain origin of the disease is stili not knovvn. Probable aetiologic factors were shown as cross reactions between antigens and immun response against to streptococcal and viral infections. There is not any patognomonic laboratory test and the diagnosis is made by clinical criterias. Free nucleic acids determined fîrst in 1948 in plasma. in subsequent years were studied in many groups such as autoimmune diseases, cancer patients and for prenatal diagnosis and provided a possibility of non-invasive diagnosis for these groups. Despite the releasing mechanism of the nucleic acids in plasma ör serum was not exactly knovvn, the existing in the form of mononucleosom let us think that it can take origin from apoptosis. Although many techniques were used for the assessment of circulating free nucleic acids, recently the most used method is quantitative real-time PCR which is modified form of PCR and provides real-time determination. in varios studies, high levels of circulating free nucleic acid were reported in many systemic autoimmune diseases such as romatoid arhritis, systemic lupus erytematosus and systemic sclerosis. Also Behçet's disease was known as a multisystemic inflamatory disease. Therefore high levels of circulating free nucleic acid were expected in Behçet's disease. This height of levels may be an important non- invasive marker for the clarifying of etiopathogenesis, diagnosis and follow-up of the disease. Because of the lack about this subject in literatüre, we designed a study to assess the levels of circulating free nucleic acid in the patients of Behçet's disease. IX50 patients (23 male, 27 female and mean age 35.28Ü0.25) applied to Dermatologie and Eye Disease Departments of Ondokuz Mayıs University Faculty of Medicine and diagnosed as a Behcet's disease were accepted to this study. 29 healty induviduals (13 male, 16 female and mean age 36.14±9.18) were selected as a control group. 4.5 mL of whole blood from patient and controls were collected in K3-EDTA tubes. The levels of free nucleic acid were quantified with real-time PCR method in plasma obtained from whole blood. The patient of Behcet's disease with and without uveitis and the control group were compored with each other. With regard to our reports, any statistically significance was not detected between these groups. There was not found any significant relation between the groups according to the activity and duration of disease and sex as a result of statistically evaluation as well. We thing that these results could able to be explained through the short half time of plasma nucleic acids. In this respect it may be more meaningful approach to research the DNA damage in the patients of Behcet's disease as well as the detecting of plasma free nucleic acid levels. On the other hand it can be proposed the evaluation of the expression of apoptotic genes to detect apoptosis, which expected as effective in DNA damage and exiting of DNA to extracelluler area. In the last 15-20 years, an interest in the applications for circulating DNA is increased rapidly from day to day. In addition to our results that performed about free nucleic acids in plasma and serum, which may give rise to appear new areas for research and supply new approachs in molecular diagnosis. The developments in this area are calling attention to the possibility of non-invasive diagnosis and treatment for the various diseases such as cancer, autoimmune disorders and for prenatal diagnosis and transplantation. Key words: Behcet's disease, real-time PCR, free nucleic acid X