HepG2 hücre kültürlerinde ouabainin mitokondriyal genom üzerindeki etkilerinin moleküler yöntemlerle araştırılması

Abstract

Ouabain, konjestif kalp yetmezliği tedavisinde kullanılan, kardiyotonik steroitler sınıfına ait spesifik Na+/K+-ATPaz inhibitörüdür. Ouabainin insan karaciğer kanser hücrelerinde apopitoz gelişiminde ve reaktif oksijen ürünleri (ROÜ) oluşumunda rol aldığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Ancak, ouabainin mitokondriyal DNA (mtDNA) üzerine etkileri tam olarak bilinmemektedir.Glukoz yoksunluğu, solid tümörlerin merkezi bölgesinde oluşan ve kemoterapiye rezistansı indükleyen bir durumdur. Glukoz yoksunluğu oluşturan 2-Deoksiglukoz (2-DG) glikolizi inhibe eden sentetik bir glukoz analoğudur.ROÜ, DNA üzerinde tek ve çift zincir kırıkları, modifiye pürin ve pirimidin bazları oluşumu gibi değişik lezyonlara yol açarak hasar oluşturabilmektedir. mtDNA'da görülen yaygın delesyon 4977 baz uzunluğundadır ve mtDNA'nın replikasyonu sırasında oluşabileceği gibi serbest radikallerin üretilmesi ile de ilişkili olabilir. mtDNA4977 delesyonu ve mtDNA lezyon frekansı genellikle oksidatif hasarın belirteci olarak kullanılmaktadır.Bu çalışmadaki amacımız, HepG2 hücrelerinde mtDNA4977 delesyonunu ve mtDNA lezyon frekansını inceleyerek ouabainin mitokondriyal DNA üzerine olan etkilerini araştırmaktır. Bu amaçla HepG2 hücreleri 96-kuyucuklu pleytte (5x103 hücre/kuyucuk) bir gece kültüre edildi ve ardından 10 mM 2-DG varlığında ve yokluğunda 0.75 nM, 7.5 nM, 75 nM ve 750 nM ouabain ile 24 saat muamele edildi. Ayrıca 10 mM 2-DG verilen grup ve herhangi bir ilacın uygulanmadığı kontrol grubu oluşturuldu. HepG2 hücrelerinden nükleer ve mitokondriyal DNA izolasyonu yapıldı. Long PCR ve kantitatif PCR yöntemleri ile numunelerin mtDNA4977 delesyon frekansı, lezyon frekansı ve hücre başına düşen mitokondriyal DNA kopya sayıları bulundu.Çalışmamızda, tek başına 2-DG uygulanan grupta, mtDNA kopya sayısı 1.49 kat ve mtDNA lezyon frekansı 1.9 kat artarken mtDNA4977 delesyon frekansı değişmedi. Tek başına 75 nM ouabain mtDNA kopya sayısını 0.75 kat azaltırken, 7,5 nM ve 0,75 nM ouabain dozları ise sırasıyla 1.67 ve 1.95 kat arttırdı. 2-DG ile kombine tüm ouabain dozlarında mtDNA kopya sayısı yaklaşık 1.4 kat arttı. Tek başına 750 nM, 75 nM ve 7,5 nM ouabain dozları mtDNA4977 delesyonunu sırasıyla 1.39, 1.92 ve 1.44 kat arttırdı. 2-DG ile kombine 750 nM ve 75 nM ouabain dozları mtDNA4977 delesyonunu sırasıyla 4.94 ve 1.57 kat arttırırken kombine 7,5 nM ouabain dozunda anlamlı bir değişiklik olmadı. Tek başına 750 nM ve 75 nM ouabain dozları mtDNA lezyon frekansını 2.5 ve 1.5 kat arttırdı. 2-DG ile kombine 750 nM ouabain dozu mtDNA lezyon frekansını 2.28 kat arttırırken kombine 75 nM ouabain dozunda anlamlı bir değişiklik olmadı. Tek başına ve 2-DG ile kombine 7,5 nM ouabain dozu mtDNA lezyon frekansını sırasıyla 0.67 ve 0.45 kat azalttı.Sonuç olarak, ouabain hem tek başına hem de 2-DG ile kombine iken mtDNA lezyon frekansını ve mtDNA4977 delesyonunu arttırmaktadır ve bu artış ouabainin oksidatif stres oluşturarak DNA hasarı ve apopitozisi indüklediği savını desteklemektedir.Anahtar Kelimeler: Ouabain, Delesyon, 2-Deoksiglukoz, Reaktif Oksijen Ürünleri, Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Ouabain, which is used for congestive heart failure treatment, is a specific Na+/K+-ATPaz inhibitor and it belongs to class of cardiotonic steroids. It has been indicated in the studies that ouabain plays a role on developing apoptosis in human liver cancer cells and in the formation of reactive oxygen species (ROS). But, the effects of ouabain on mitochondrial DNA (mtDNA) are not completely known yet.Absence of glucose is a condition that occurs in the centre of solid tumour and induces resistance to chemotherapy. 2-deoxyglucose (2-DG) developing absence of glucose is a synthetic glucose analogous inhibiting glycolysis.ROS leading different lesions such as modified purine and pyrimidine bases, can cause damage single and double chain breaks on DNA. Common deletion which has been seen in mtDNA is 4977 base length and it might be occured during replication of mtDNA as well as it might be related to generation of free radicals. mtDNA4977 deletion and mtDNA lesion frequency are generally used as reagents of oxidative damage.Our purpose in this study is to research the effects of ouabain on mitochondrial DNA by analysing mtDNA4977 deletion and mtDNA lesion frequency in HepG2 cells. For this purpose, HepG2 cells were cultured in 96 well culture plates (5x103 cell/well) overnight and then they were treated with ouabain of 0.75 nM, 7.5 nM, 75 nM and 750 nM in the presence and absence of 10 mM 2-DG. Also a group that was given 10 mM 2-DG and a control group that was not received any medication were created. Nuclear and mitochondrial DNA isolation from HepG2 cells were implemented. mtDNA4977 deletion frequency, lesion frequency and mitochondrial DNA copy numbers for per cell of the samples were determined by long PCR and quantitative PCR methods.In our study, in the group that applied 2-DG alone, while the copy number of mtDNA has increased 1.49 times and lesion frequency of mtDNA has increased 1.9 times, deletion frequency of mtDNA4977 has not been changed. 75 nM ouabain alone has decreased the copy number of mtDNA 0.75 times, alone 7,5 nM and 0,75 nM ouabain doses have increased respectively 1.67 and 1.95 times. Inturns in all ouabain doses with 2-DG, copy number of mtDNA has increased approximately 1.4 times. 750 nM, 75 nM and 7,5 nM ouabain doses alone have increased mtDNA4977 deletion respectively 1.39, 1.92 and 1.44 times. While 750 nM and 75 nM ouabain doses combined with 2-DG have increased mtDNA4977 deletion respectively 4.94 and 1.57 times, there was no significant change in combined 7,5 nM ouabain. 750 nM and 75 nM ouabain doses have alone increased the lesion frequency of mtDNA 2.5 and 1.5 times. While 750 nM ouabain dose combined with 2-DG has increased the lesion frequency of mtDNA 2.28 times, there was not occured significant change in combined 75 nM ouabain dose. 7,5 nM ouabain dose combined with 2-DG has alone decreased the lesion frequency of mtDNA respectively 0.67 and 0.45 times.As a result, ouabain both alone and when combined with 2-DG increases mtDNA lesion frequency and mtDNA4977 deletion and this increase supports the thesis that ouabain generate oxidative stress and induces DNA damage and apoptosis.Key Words: Ouabain, Deletion, 2-Deoxyglucose, Reactive Oxygen Species, Polymerase Chain Reaction