Escherichia coli ve Klebsiella spp. klinik izolatlarında plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz tespiti

Abstract

Escherichia coli ve Klebsiella spp. türlerinde plazmid aracılıAmpC beta-laktamaza bağlı direnç tüm dünyada ortaya çıkan birproblemdir. Yüksek düzey AmpC beta-laktamaz üretimi karbapenemve sefepim dısında tüm beta-laktam antibiyotiklere dirençli seklindeyorumlanmaktadır. AmpC beta-laktamaz üretenmikroorganizmaların tespiti daha etkin tedavi ve klinik sonuçlara yolaçmaktadır. Bununla birlikte AmpC beta-laktamazın tespitineyönelik CLSI önerileri olmamasından dolayı bu durumlaboratuvarlar için önemli bir sorundur. Biz de çalısmamızda değisikyöntemler kullanarak klinik izolatlarda plazmid aracılı AmpC betalaktamaztespit etmeyi amaçladık.Çalısmamızda Hacettepe Üniversitesi Hastanesinde izoleedilmis sefoksitin, amoksisilin klavulanik asit, aztreonam vesefalosporinlerden herhangi birine dirençli olan 290 klinik E.coli veKlebsiella spp. izolatı test edildi. ?zolatlardan 214'ü Ocak 2005-Aralık 2006 tarihleri arasında izole edilen kan izolatları iken, 76'sıOcak 2007-Haziran 2007 tarihleri arasında izole edilen kan dısı(idrar, balgam vs.) izolatlardı. ?zolatların tanımlanması için Phoenixotomatize sisteminden yararlanıldı.Plazmid aracılı AmpC beta-laktamazın fenotipik olaraktespiti için indüklenebilirlik testi, boronik asit ile inhibisyon testi, üçboyutlu test ve izoelektrik odaklama testi yapıldı. Boronik asit ileinhibisyon testinde 80 izolatta pozitiflik saptanırken teste klavulanikasit ekleyerek GSBL'nin inhibisyonu ile bu sayının 41'e düstüğügözlendi. Üç boyutlu test ile 27 izolatta pozitiflik saptanırken 17izolatta süpheli sonuç bulundu. Bu izolatların izoelektrik odaklamatestinde izoelektrik noktaları (pI) 4.3 ile 9.1 arasında tespit edildi.Multipleks PCR ile bu izolatlardan yedisinde plazmid aracılı AmpCbeta-laktamaza ait bant gösterildi. Bunlardan altısındaindüklenebilirlik pozitif iken bir tanesi beraberinde GSBLiçermekteydi.Sonuç olarak AmpC beta-laktamazın fenotipik olarak tespitiiçin boronik asit inhibisyon testi, uygulanması basit ve yorumukolay bir testtir. Ancak burada GSBL'nin yalancı pozitif sonuçlarınıönlemek için teste klavulanik asit eklenmelidir. Fenotipik testler herne kadar AmpC beta-laktamaza bağlı sefoksitin direncini porindefektine bağlı dirençten ayırt edebilse de bunun kromozomal veyaplazmid aracılı olduğunu belirleyememektedir. pAmpC'nin kesintanısı için en güvenilir yöntem moleküler yöntemler olmakla birliktemoleküler testler rutin laburatuvarda uygulanması zor yöntemlerdir.

Plasmid mediated AmpC beta-lactamase is an emergingantibiotic resistance problem all over the world. High level Amp Cbeta-lactamase production is typically associated with in vitroresistance to all beta-lactam antibiotics except for carbapenems andcefepime. Detection of AmpC beta-lactamase producing organismsis important to ensure effective therapeutic intervention andoptimal clinical outcome. Nevertheless detection of plasmidmediated AmpC beta-lactamase is a challenge for laboratories. Inaddition there is no CLSI guideline for its detection. We wished toaddress this issue by studying different methods for the detection ofAmpC beta-lactamases.A total of 290 clinically relevant isolates of E.coli andKlebsiella spp., resistant to cefoxitin, amoxycillin-clavulanic acid,aztreonam, and any cephalosporines, identified at HacettepeUniversity Hospital were included in this study. Of the isolatesincluded 214 were from blood between January 2005 and December2006 and 76 were from samples other than blood (urine, sputumetc.) between January 2007-June 2007. Strains were identified byPhoenix automatized system (Becton Dickinson, USA).For the phenotypic detection of plasmid mediated AmpCbeta-lactamases inducibility test, boronic acid inhibition test,modified-three dimendional test and isoelectric focusing were used.Boronic acid inhibition test yielded positive result in 80 isolates.When clavulanic acid was added to boronic acid inhibition test, thenumber of positive isolates decreased to 41 due to the inhibition ofextended spectrum beta lactamase (ESBL) with clavulanic acid.Modified-three dimensional test revealed 27 positive and 17intermediate results among 290 isolates. Isoelectric focusingdetected isoelectric points differing from 4.3 and 9.1. Seven ofthese positive isolates were confirmed by multiplex PCR to harborplasmid mediated AmpC beta-lactamase genes. Six of them wereinducible and one of them had ESBL as well.In conclusion, for the phenotypic detection of AmpC beta -lactamases, boronic acid inhibition test is simple to perform andeasy to interpret. However, in order to prevent the masking effectof ESBL, clavulanic acid must be added to boronic acid inhibitiontest. Phenotypic tests can not distinguish plasmid mediated andchromosomal AmpC beta-lactamases, however they can distinguishresistance of cefoxitin due to porin mutations. For the definitedetection of plasmid mediated AmpC beta-lactamase the mostreliable test is molecular method, however, molecular tests arelaborious and expensive for use in routine microbiologylaboratories.