Enzimatik biyoanalizlerin izlenmesine yönelik etkin elektrokimyasal yöntemlerin geliştirilmesi: Biyosentri-voltammetri ve nanoyapı temelli sistemler

Abstract

Bu doktora tezinde sentri-voltammetri ilk kez biyosensör sistemi ile birleştirilmiştir. Bu yönteme biyosentri-voltammetri (aynı zamanda sentri-biyovoltammetri olarak da bilinmektedir) adı verilmiştir. İlk bölümde, camımsı karbon elektrot üzerine modifiye edilen Au film ile asetilkolin (ATCh) tayini gerçekleştirilmiştir. Optimum koşullar altında ATCh için analitiksel karakteristik çalışmaları yapılmıştır. İkinci bölümde, biyosentri-voltammetri ile ATCh tayini gerçekleştirilmeden önce biyosentri-voltammetri yöntemi iyi bilinen bir enzimatik sisteme uygulanmıştır. Bu amaçla, biyosentri-voltammetrik hücrenin alt kısmında bulunan Pt elektroda ksantinoksidaz enzimi immobilize edilmiş ve ksantin (X) biyosensörü elde edilmiştir. Santrifüj hızı, santrifüj süresi ve enzim miktarı gibi önemli deneysel parametreler optimize edilmiştir. Daha sonra X için analitiksel karakteristik çalışmaları yapılmıştır. Yöntem şarap örneğinde X tayinine uygulanmış ve iyi geri kazanım değerleri elde edilmiştir. Üçüncü bölümde, AChE aktivitesini tayin etmek amacıyla, ATCh?ın biyosentri-voltammetrik tayini gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon süresi, santrifüj hızı, santrifüj süresi ve enzim miktarı gibi parametreler optimize edilmiştir. Uygun çalışma şartları belirlendikten sonra ATCh için analitiksel karakteristik çalışmaları gerçekleştirlmiştir. Biyosentri-voltammetri yöntemi, asetilkolin esteraz (AChE) inhibisyon çalışması için Alzheimer hastalığında kullanılan Neurem (DonepezilHCl, 5 mg) ilacına uygulanmıştır. Dördüncü bölümde, ACh biyosentri-voltammetrik yöntem ile belirlenmiştir. Bu amaçla AChE ve kolin oksidaz (CHOD) enzimleri kullanılarak biyosensör sistemi oluşturulmuştur. Bunun için reaksiyon süresi, pH, AChE ve CHOD miktarları, santrifüj süresi ve santrifüj hızı gibi parametreler optimize edilmiştir. En iyi ortam şartları belirlendikten sonra ACh ve Ch için analitiksel karakteristikler incelenmiştir. ACh tayinine biyosentri-voltammetrinin etkisinin anlaşılması için santrifüj parametreleri kullanılmaksızın ACh için bir doğrusal aralık oluşturulmuştur. Oluşturulan biyosensör aynı zamanda Ch belirlenmesinde kullanılmıştır. Biyosentri-voltammetri yöntemi, sentetik serum örneklerinde ACh ve Ch belirlenmesine uyarlanmıştır. Son bölümde ise çok duvarlı karbon nanotüp temelli AChE biyosensör sistemi oluşturulmuştur. Zayıf bir katyonik polielektrolit olan poly(allylaminehydrochloride) (PAH) ve nitrik asit (HNO3) ile fonksiyonellendirilmiş çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT) ile AChE temelli biyosensör elde edilmiştir. AChE ve pH parametreleri optimize edildikten sonra ATCh için analitiksel karakteristik çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen biyosensör sistemi model pestisit olarak seçilen monokrotofos belirlenmesine uyarlanmıştır. İnhibisyon süresi optimize edildikten sonra % inhibisyon ile monokrotofos derişimi arasında doğrusal bir ilişki elde edilmiştir. Bundan sonra, biyosensör çeşme ve maden suyu, domates ve üzüm örneklerine uygulanmıştır.

In this PhD thesis, centri-voltammetry was combined with a biosensor system for the first time. We recommend the name ?biocentri-voltammetry? (also known as centri-biovoltammetry). In the first chapter, acetylthiocholine (ATCh) was detected by using Au film modified glassy carbon electrode. Analytical characteristics for ATCh were investigated under optimum conditions. In the second chapter, before ATCh was detected with biocentri-voltammetry, it was applied to the best known enzymatic system. For this purpose, xanthine oxidase was immobilized onto Pt electrode which placed at the bottom of the biocentri-voltammetric cell and xanthine (X) biosensor was obtained. Important experimental parameters such as centrifugation speed, centrifugation time and amount of enzyme were optimized. After that analytical characteristics for X were investigated. The method was applied to the determination of xanthine in wine sample and good recovery values were obtained. In the third chapter, ATCh was detected by using biocentri-voltammetry in order to determine AChE activity. Reaction time, centrifugation speed, centrifugation time and amount of enzyme were optimized. Under optimized conditions, analytical characteristics were investigated. Bio-centrivoltammetry method was utilized for Neurem (DonepezilHCl, 5mg) medicine which used for Alzeihmer disease in order to monitor acetylcholinesterase (AChE) inhibition. In the fourth chapter, ACh was detected by using biocentri-voltammetry. A biosensor based on AChE and choline oxidase (CHOD) was fabricated. After experimental parameters such as reaction time, pH, AChE and CHOD amount, centrifugation time and centrifugation speed were optimized, analytical characteristics were investigated for ACh and Ch. A calibration graph was obtained without biocentri-voltammetry in order to explore effect of centrifugation parameters. Obtained biosensor was also used to detect Ch. Biocentri-voltammetry was applied for determination of ACh and Ch in synthetic serum samples. In the last chapter, poly(allylaminehydrochloride) which is a weak cationic polyelectrolyte and nitric acid-treated MWCNT based AChE biosensor was fabricated. After parameters such as pH and amount of AChE were optimized, a linear range was obtained for ATCh. Monocrotophos was detected as a model pesticide with developed biosensor system. A linear relationship between inhibition % and monocrotophos concentration was obtained after optimization of inhibition time. After that, biyosensor was applied to detect monocrotophos in tomato, grape mineral and tap water samples.