Demir şelatlayıcı salisiliden asilhidrazid grubu sentetik bileşiklerin kanserli hücrelerin proliferasyonu üzerindeki etkisinin nöroblastoma hücrelerinde incelenmesi

Abstract

Demir; hücre çoğalması, metabolizması ve büyümesi için gerekli olan temel bir elementtir. Mitokondriyel enzimlerin, katalitik ve katalaz gibi detoksifiye edici yönleri için hayati önem taşır. Aynı zamanda demir, redoks döngüsü ve serbest radikal oluşumunda yer alma kapasitesine sahiptir. Bu nedenle hücre için demir hem esastır hem de potansiyel olarak toksiktir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda demirin tümör mikro çevresinde ve metastazında da rolü olduğu gösterilmiştir. Demir edinimi, akışı, depolanması ve düzenlenmesi yollarının tümü kanserin oluşumuyla yakından ilişkilidir, bu da demir metabolizmasının yeniden programlanmasının tümör hücresi sağkalımının merkezi bir yönü olduğunu gösterir. Demirin metabolik yollarını hedeflemek, kanser prognozu ve tedavisi için yeni araçlar sağlayabilir. Bu nedenle bu tez çalışmasında demir şelatlayıcı özellikleriyle bilinen salisiliden asilhidrazid sentetik grubundan ME0055 ve ME0192 bileşikleri kullanılarak kanserli SH-SY5Y (nöroblastoma hücre hattı) üzerindeki etkileri incelenmiştir. Demir şelatlayıcı bileşiklerin genel olarak hücre içinde demiri hedef alarak tümör gelişimi ve metastazda adı sıklıkla geçen ve hücre siklusunu yöneten siklin, CDK gibi moleküller üzerinde, ayrıca PI3K/AKT ve ERK/MAPK gibi sinyal yolları üzerinde etkili oldukları bilinmektedir. Bu nedenle bu araştırmada ME0055 ve ME0192 demir şelatlayıcı bileşiklerinin hücrelerin canlılığına ve proliferasyon hızına olan etkisi hem ERK/MAPK ve PI3K/AKT sinyal yolları üzerinden, hem de bu iki sinyal yolunun iletişiminde rolü olması kuvvetle muhtemel olan mitotik Speedy/RINGO proteini üzerinden, ayrıca apoptotik bir belirteç olan aktif kaspaz-3 miktarının ölçülmesi ile araştırılmıştır. Bu iki bileşiğin hücre canlılığı üzerindeki etkisinin anlaşılabilmesi için 10x105 hücreye MTT analizi yapılarak yarı-maximal inhibitör konsantrasyon (IC50) için uygun doz 50µM olacak şekilde belirlenmiştir. Daha sonra hücrelerden total protein izolasyonu sonucunda western blotlama yapılarak kullanılan demir şelatlayıcıların hücrelerin proliferasyon hızına olan etkisi hem ERK/MAPK ve PI3K/AKT sinyal yolları üzerinden, hem de bu iki sinyal yolunun iletişiminde rolü olması muhtemel mitotik Speedy/RINGO proteini ekspresyonu üzerinden kontrol hücrelerine kıyasla incelenmiştir. Hücre siklus regülatörü olan Speedy/RINGO seviyesinde gözlemlenen düşüşle beraber PI3K/AKT yolağındaki fosforilasyon seviyesinin, dolayısıyla bu yolağın aktivitesinin düştüğü görülmüştür. Bu durum ME0055 ve ME0192 demir şelatlayıcılarının Fe+2 ile ektileşime girerek AKT sinyal yolunun inhibitör proteini olan PTEN aktivitesinde artışa sebep olması, ya da PI3K'ın PIP3ile etkileşime girmesini engellemesinden kaynaklı olabileceği gibi ERK/MAPK ve PI3K/AKT sinyal yolları üzerinde regülatör etkisi bulunan Speedy/RINGO ekspresyonunu düşürmesinden kaynaklı olabileceği de akla gelmektedir. ERK/MAPK yolağındaki verilerde ise bileşiklerin etkisinin daha düşük seviyede olduğu gözlemlense de sonuçların istatiksel olarak anlamlı oluşu göze çarpmaktadır. Son olarak kaspaz-3 aktivitesine bakıldığında ise bileşiklerin (ME0055 ve ME0192) sırasıyla kanserli SH-SY5Y hücrelerinde %90, %175 oranında arttığı saptanmıştır. Bu çalışmadan elde edilen çıktılar kanserleşmede önemli rolü olan ERK/MAPK ve PI3K/AKT sinyal yolları ve bunların kesişiminde yer alarak kanserleşmeyi tetiklediği düşünülen Speedy/RINGO proteininin regülasyonunda rol oynayan demir metabolizması bozuklukları gibi temel nedenlerin anlaşılmasına ve bu şekilde sentetik olan demir şelatlayıcıların terapötik amaçlı kullanım için geliştirilmesine ışık tutacaktır.Anahtar Kelimeler: Salisiliden asilhidrazitler, Nöroblastoma kanseri, ME0055,Speedy/RINGO, ME0192, p-AKT, MAPK, Kaspaz-3

Iron; It is an essential element necessary for cell proliferation, metabolism and growth. It is vital for detoxifying aspects of mitochondrial enzymes, such as catalytic and catalase. It is also capable of taking part in the redox cycle and free radical formation. Thus, iron is both essential and potentially toxic to the cell. Recent studies have shown that iron has a role in tumor microenvironment and metastasis. All of the ways of iron uptake, flow, storage and regulation are closely related to the occurrence of cancer, indicating that reprogramming iron metabolism is a central aspect of tumor cell survival. Targeting the metabolic pathways of iron may provide new tools for cancer prognosis and treatment. Therefore, in this thesis, the effects of ME0055 and ME0192 from salicylidene acylhydrazide synthetic group known on iron chelating properties on cancer SH-SY5Y (neuroblastoma cell line) were investigated. Iron chelating compounds are generally known to act on molecules in the cell cycle, such as cyclin, CDK, often referred to in tumor growth and metastasis, targeting iron within the cell, as well as signaling pathways such as PI3K / AKT and ERK / MAPK. Therefore, in this study, the effect of ME0055 and ME0192 iron chelating compounds on cell viability and proliferation rate of both the ERK / MAPK and PI3K / AKT signaling pathways, as well as mitotic Speedy / RINGO protein, which are likely to have a role in the communication of these two signaling pathways, are also apoptotic active caspase-3, which is a marker. In order to understand the effect of these two compounds on cell viability, MTT analysis was performed to 10x105 cells and the appropriate dose for the half-maximal inhibitory concentration (IC50) was determined as 50µM. The effect of the iron chelators on the proliferation rate of the cells by Western blotting as a result of total protein isolation from the cells was compared to the control cells by means of both ERK / MAPK and PI3K / AKT signaling pathways and mitotic Speedy / RINGO protein expression, which is likely to have a role in the communication of these two signaling pathways. It was investigated. The decrease in the level of phosphorylation in the PI3K / AKT pathway, and thus the activity of this pathway, was observed with the decrease observed in the cell cycle regulator Speedy / RINGO level. This may be due to the activation of the chelators of ME0055 and ME0192 by Fe+2, causing an increase in the inhibitory protein PTEN activity of the AKT signaling pathway, or preventing PI3K from interfering with PIP3, as well as regulating effect on ERK / MAPK and PI3K / AKT signaling pathways. It is also possible that Speedy / RINGO may be caused by lowering expression. The data on the ERK / MAPK pathway showed that the effect of the compounds was lower, but the results were statistically significant. Finally, when the caspase-3 activity was examined, it was found that the compounds (ME0055 and ME0192) increased 90% and 175% in cancerous SH-SY5Y cells, respectively. The results of this study will shed light on the understanding of the underlying causes such as MAPK and Akt signaling pathways, which play an important role in cancer, and the iron metabolism disorders involved in the regulation of the Speedy / RINGO protein, which is thought to trigger cancer, and to develop the synthetic iron chelators for therapeutic use.Keywords: Neuroblastoma Cancer, Salicylidene acylhydrazide, ME0055, Speedy/RINGO, ME0192, p-AKT, MAPK, Caspase-3